Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток
Summary
Мы представляем протокол для обозначения и анализа пирамидальных нейронов, что имеет решающее значение для оценки потенциальных морфологических изменений в нейронах и дендритных позвоночниках, которые могут лежать в основе нейрохимических и поведенческих аномалий.
Abstract
Сообщалось, что размер и форма дендритных шипов связаны с их структурной пластичностью. Для определения морфологической структуры пирамидальных нейронов и дендритных шипов можно использовать метод баллистической маркировки. В настоящем протоколе, пирамидальные нейроны помечены с ДилC18(3) красителя и проанализированы с помощью программного обеспечения реконструкции нейронов для оценки морфологии нейронов и дендритных шипов. Для исследования структуры нейронов выполняются дендритный анализ ветвления и анализ Sholl, позволяющий исследователям делать выводы о дендритной сложности ветвления и сложности нейрональной беседки, соответственно. Оценка дендритных шипов проводится с использованием алгоритма автоматической ассистированной классификации, неотъемлемой частью программного обеспечения реконструкции, который классифицирует шипы на четыре категории (т.е. тонкие, грибные, коренастые, филоподия). Кроме того, для оценки изменений в морфологии дендритного позвоночника выбираются дополнительные три параметра (т.е. длина, диаметр головы и объем). Для проверки потенциала широкого применения метода баллистической маркировки, пирамидальные нейроны из культуры клеток in vitro были успешно помечены. В целом, метод баллистической маркировки уникален и полезен для визуализации нейронов в различных областях мозга у крыс, что в сочетании со сложным программным обеспечением реконструкции позволяет исследователям выяснить возможные механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивная дисфункция.
Introduction
В 2000 году Gan et al. описали технику быстрой маркировки для отдельных нейронов и глии в нервной системе, которая сочетала в себе различные липофильные красители, что позволило одновременно маркировать многие клетки мозга разными цветами1,2. Совсем недавно, метод баллистической маркировки был описан Seabold et al.3, которые ввели флуоресцентные красители (Dil) в нейроны ломтиков мозга. Универсальный метод окрашивания, баллистическая маркировка ценится за его способность быть использованы в нескольких видов животных и в широком диапазоне возрастов. Кроме того, он может быть объединен с иммунотированием для выявления субпопуляций клеток мозга3. По сравнению с традиционными методами (например, пропитка серебра Golgi-Cox, микроинъекция)4, баллистическая маркировка дает возможность более четко различать морфологические характеристики, в том числе дендритные шипы, особенность, которая имеет решающее значение для рисования выводов о нейронной сложности и синаптической связи5.
Возбуждение пирамидальных нейронов характеризуется одним, большой атический дендрит, несколько коротких базальных дендритов, и тысячи дендритных шипов6. Пирамидальные нейроны находятся в нескольких областях мозга, связанных с когнитивной обработкой более высокого порядка, включая префронтальную кору (PFC) и гиппокамп. В PFC пирамидальные нейроны наблюдаются в слоях II/III и слой V, при этом каждый из них демонстрирует уникальную морфологию. В частности, пирамидальные нейроны в слое II/III ПФУ имеют более короткий апикальный дендрит и меньше ветвления, чем пирамидальные нейроны в слое V6. В гиппокампе, пирамидальные нейроны расположены в обоих регионах CA1 и CA3, с каждым отображением различных морфологий. В частности, пирамидальные нейроны в регионе CA1 обладают более отличительной актикальный дендрит, с разветвления происходящих дальше от сомы, по отношению к CA3 регионе6.
Дендритные шипы на пирамидальных нейронов в пФУ и гиппокампе являются основным местом возбуждания синапсов7. Морфологические характеристики дендритных шипов, которые классически характеризуются на три основные категории (т.е. тонкие, коренастые илигрибы 8),были связаны с размером возбуждающей синапса9. Тонкие шипы, характеризующиеся длинной, тонкой шеей, маленькой луковичной головой и более мелкими постсинаптическими плотностями, более нестабильны и развивают слабые связи. Тем не менее, грибные шипы, которые имеют большую дендритную голову позвоночника, признаются для формирования более сильных синаптических связей, эффект в результате их большего размера. В резком контрасте, коренастый шипы лишены шеи позвоночника, демонстрируя примерно равные головы и шеи соотношение объема8. В гиппокампе, разветвленные шипы также могут наблюдаться, в котором позвоночник имеет несколько голов, которые возникают из той же дендритной шеи позвоночника10. Таким образом, морфологические изменения дендритных шипов могут отражать функциональность и структурные возможности. Кроме того, исследования показали, что размер и форма дендритных шипов относится к их структурной пластичности, что приводит к мысли, что небольшие шипы участвуют в обучении и внимания, в то время как большие, более стабильные шипы, участвуют в долгосрочных процессах, в том числе памяти11. Кроме того, распределение дендритных шипов вдоль дендрита может быть связано с синаптической связью5,,12.
Таким образом, в настоящем методологическом документе есть три цели: 1) Представить наш протокол для баллистической маркировки, который был использован с успехом (т.е. нейроны удовлетворения критериев отбора и подходит для анализа) 83,3%5,12,13 и через несколько областей мозга (т.е. PFC, ядро accumbens, гиппокамп); 2) Продемонстрировать обобщаемость техники и ее применение к нейронам, выращенным в пробирке; 3) Подробно методология, используемая в нейронной реконструкции программного обеспечения и выводы, которые могут быть сделаны из таких данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем разностороннюю технику маркировки нейронов как из мозга крыс, так и из тех, которые выращивают в пробирке. Кроме того, мы сообщаем о методологии использования программного обеспечения реконструкции нейронов и программного обеспечения количественного ана…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет грантов NIH HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
Referenzen
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurowissenschaften. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neurowissenschaften. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
