التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو حقن رودامين مترافقة في شكل اجناة دوزوفيليا وصورة إيننويا actin قضبان الجمعية بعد الإجهاد الحراري.
Abstract
الغرض من هذا البروتوكول هو تصور قضبان actin داخل النواة التي تجمع في الأجنة الزهرية الميلانوغاستر الحية بعد الإجهاد الحراري. قضبان Actin هي السمة المميزة لاستجابة الإجهاد Actin المحفوظة وغير القابلة للانكولوجيا (ASR) التي ترافق الأمراض البشرية ، بما في ذلك الأمراض العصبية. في السابق، أظهرنا أن ASR يساهم في فشل التشكلات المُرفَضة وتقليل قدرة الأجنة النامية على البقاء. يسمح هذا البروتوكول بالدراسة المستمرة للآليات الكامنة في تجميع القضيب ACTIN و ASR في نظام نموذجي قابل للغاية للتصوير وعلم الوراثة والكيمياء الحيوية. يتم جمع الأجنة وتركيبها على غطاء لإعدادها للحقن. يتم تخفيف رودامين مترافقة غلوبال أكتين (G-actinالأحمر)وتحميلها في microneedle. يتم إجراء حقنة واحدة في مركز كل جنين. بعد الحقن ، يتم احتضان الأجنة في درجة حرارة مرتفعة ويتم تصور قضبان actin داخل النواة عن طريق المجهر confocal. ويمكن إجراء عملية استعادة الفلوريسنس بعد تجارب التحسس الضوئي (FRAP) على قضبان أكتين؛ ويمكن أيضا أن تكون صورت غيرها من الهياكل أكتين الغنية في السيتوبلازم. نجد أن G-actinRedizes مثل G-actin الذاتية ولا تتداخل، من تلقاء نفسها، مع تطور الجنين الطبيعي. أحد القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أنه يجب توخي الحذر أثناء الحقن لتجنب الإصابة الخطيرة بالجنين. ومع ذلك، مع الممارسة، حقن G-actinالأحمر في الأجنة Drosophila هو وسيلة سريعة وموثوق بها لتصور قضبان actin ويمكن بسهولة أن تستخدم مع الذباب من أي نوع جيني أو مع إدخال ضغوط الخلوية الأخرى، بما في ذلك نقص الأكسجة والأكسدة.
Introduction
يصف هذا البروتوكول كيفية حقن G-actinRed لتصور تجميع قضبان actin داخل النواة في الأجنة التي تعاني من الإجهاد الحراري التي تخضع لاستجابة الإجهاد Actin غير القابلة للتحميل (ASR)1. وضعنا هذا البروتوكول لمساعدة الدراسات من ASR، والتي في الأجنة يؤدي إلى انقطاع morphogenesis وانخفاض الجدوى، وفي أنواع الخلايا البشرية الكبار يرتبط مع الأمراض بما في ذلك الفشل الكلوي2, اعتلالات العضلات3, ومرض الزهايمر وهنتنغتون4,5,6,7,8. هذا ASR هو الناجم عن العديد من الضغوط الخلوية، بما في ذلك الصدمة الحرارية9،10،11، الإجهاد التأكسي4،6، انخفاض ATP التوليف12، وغير طبيعي Huntingtin أو β-amyloid oligomerization4،5،6،7،9،13،14،16. السمة المميزة لـ ASR هي تجميع قضبان actin الشاذة في إما السيتوبلازم أو نواة الخلايا المصابة ، والتي تحركها فرط النشاط الناجم عن الإجهاد من بروتين التفاعل actin ، Cofilin1،5،6،10. ولسوء الحظ، لا تزال هناك فجوات معرفية رئيسية فيما يتعلق بـ ASR. على سبيل المثال، وظيفة قضبان actin غير معروف. نحن لا نفهم لماذا قضبان تشكل في السيتوبلازم لبعض أنواع الخلايا، ولكن نواة الآخرين. كما أنه ليس من الواضح ما إذا كان ASR وقائيًا أو غير مُبطِل للخلايا أو الأجنة التي تخضع للإجهاد. وأخيرا، ما زلنا لا نعرف الآليات التفصيلية الكامنة في Cofilin فرط التنشيط أو actin قضبان الجمعية. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول فحص سريع ومتعدد الاستخدامات للتحقيق في ASR عن طريق تصور تشكيل قضيب actin وديناميكية في النظام التجريبي القابلة للتصرّف للغاية من جنين ذبابة الفاكهة الحية.
تم تطوير بروتوكول microinject G-actinRed في أجنة دروسوفيليا الحية في البداية لدراسة ديناميات هياكل cytoplasmic الطبيعية17 خلال أحداث بناء الأنسجة. في تلك الدراسات، وجدنا أنحقنة G-actin Red لم تؤثر سلبًا على عمليات النمو المبكرة في الجنين، بما في ذلك تحلل السيتوكينات أو17،18. ثم قمنا بتعديل البروتوكول ، وتكييف معالجة الجنين وحقن G-actinRed للسماح بتصوير قضبان actin في الأجنة المجهدة الحرارية التي تخضع لـ ASR1. يمكن استخدام طرق أخرى إلى جانب حقن G-actinRed لتصور actin في الأجنة. هذه الأساليب تعتمد على التعبير عن البروتينات الفلورية (FPs) الموسومة إلى actin أو إلى مجالات البروتينات الملزمة actin ، مثل Utrophin- mCherry ، Lifeact ، F-tractin -GFP ، وMoesin -GFP (استعرضت في19). ومع ذلك، فإن استخدام هذه المسابير FP يتطلب الحذر لأنها يمكن أن تستقر أو تعطل بعض الهياكل actin، لا تسمية على قدم المساواة جميع الهياكل actin20، وفي حالة actin-GFP، هي مفرطة جدا – إشكالية لتحليل الجمعية قضيب الذي لا يقتصر على الإجهاد تعتمد ولكن أيضا actin التركيز تعتمد1. وهكذا، G-actinالأحمر هو المسبار المفضل لدراسات قضيب في الأجنة تطير، وحجم كبير من الجنين يسمح حقنه سهلة.
سير عمل هذا البروتوكول مشابه لتقنيات الحقن المجهرية الأخرى الراسخة التي استخدمت لحقن البروتينات والأحماض النووية والعقاقير والمؤشرات الفلورية في الأجنة الدروسوفيا 21،22،23،24،25،26،27. ومع ذلك، بعد الحقن المجهري من G-actinالأحمر هنا، والأجنة تتعرض لضغوط الحرارة خفيفة للحث على ASR وداخل النواة actin قضبان التجميع. بالنسبة للمختبرات التي والحصول على الذباب وتلاعب الحقن، ينبغي أن تكون هذه الطريقة قابلة للتنفيذ بسهولة وقابلة للتكيف مع خطوط محددة للدراسة فيما يتعلق بـ ASR، بما في ذلك تحريضها من خلال ضغوط مختلفة أو تعديل في خلفيات جينية متميزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهمية هذه الطريقة هي أنها تستخدم بروتوكول راسخ من الحقن المجهري في الأجنة دروسوفيليا 21,22,23,24,25,26,27 لتمكين البحوث الجديدة بشأن ASR و المرافقة actin قضبان التجميع….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفان بامتنان بعمل ليوليو تشنغ وتسنغ هوي شيويه، اللذين ساعدا في ريادة هذه التقنية في مختبر سوكاك، وكذلك حسن سيد الذي ساعد في التحليل. يتم تمويل العمل لهذه الدراسة من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة (R01 GM115111).
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
Referenzen
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Entwicklungsbiologie. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
