Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов
Summary
Цель этого протокола заключается в том, чтобы ввести родамина конъюгированных шаровых актин в дрозофила эмбрионов и изображения внутриядерных актин стержня сборки после теплового стресса.
Abstract
Целью данного протокола является визуализация внутриядерных актин-стержней, которые собираются в живых эмбрионах drosophila melanogaster после теплового стресса. Actin стержней являются отличительной чертой сохраняется, неудобоваемые Actin стресс ответ (ASR), который сопровождает человеческие патологии, в том числе нейродегенеративных заболеваний. Ранее мы показали, что ASR способствует морфогенеза неудачи и снижение жизнеспособности развивающихся эмбрионов. Этот протокол позволяет продолжить изучение механизмов, лежащих в основе сборки актин стержня и ASR в модельной системе, которая очень податлима для визуализации, генетики и биохимии. Эмбрионы собираются и устанавливаются на крышку, чтобы подготовить их к инъекциям. Родамин-конъюгированный шаровые актин (G-actinRed) разбавляется и загружается в микроиглу. В центр каждого эмбриона делается одна инъекция. После инъекции эмбрионы инкубируется при повышенной температуре, а внутриядерные актиновые стержни визуализируются с помощью конфокалярной микроскопии. Восстановление флуоресценции после фотоотбивания (FRAP) эксперименты могут быть выполнены на актин стержней; и другие богатые актином структуры в цитоплазме также могут быть изображены. Мы находим, чтоG-актин красный полимеризируется как эндогенный G-актин и не, сам по себе, вмешиваться в нормальное развитие эмбриона. Одним из ограничений этого протокола является то, что необходимо позаботиться о том, чтобы во время инъекции избежать серьезных повреждений эмбриона. Однако, с практикой, инъекционные G-актинкрасный в drosophila эмбрионов является быстрым и надежным способом визуализации актин стержней и может быть легко использован с мухами любого генотипа или с введением других клеточных стрессов, в том числе гипоксии и окислительного стресса.
Introduction
Этот протокол описывает, как вводить G-actinRed, чтобы визуализировать сборку внутриядерных актин-стержней в термечных эмбрионах, которые проходят неопругиваемый actin Stress Response (ASR)1. Мы разработали этот протокол, чтобы помочь исследованиям ASR, который в эмбрионах приводит к нарушению морфогенеза и снижению жизнеспособности, а у взрослых типов клеток человека связано с патологиями,включая почечную недостаточность 2,мышечные миопатии 3, и болезнь Альцгеймераи болезнь Хантингтона 4,5,6,7,8. Это ASR вызвано многочисленными клеточными напряжениями, в томчисле тепловой шок 9,10,11,окислительный стресс 4,6, снижениесинтеза АТФ 12, и ненормальные Хантингтин или β-амилоидаолигомеризации 4,5,6,7,9,13,14,15,16. Отличительной чертой ASR является сборка аноматических актиновых стержней либо в цитоплазме, либо в ядре пораженных клеток, что обусловлено вызванной стрессом гиперактивацией актин-взаимодействующих белков, cofilin1,5,6,10. К сожалению, по-прежнему сохраняются пробелы в знаниях в отношении ASR. Например, функция актин-стержней неизвестна. Мы не понимаем, почему стержни образуются в цитоплазме некоторых типов клеток, но ядро других. Также не ясно, является ли ASR защитным или неадаптивным для клеток или эмбрионов, переживая стресс. Наконец, мы до сих пор не знаем подробных механизмов, лежащих в основе гиперактивации Cofilin или сборки актин стержня. Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и универсальный анализ для зондирования ASR путем визуализации актин формирования стержня и динамики в высокоуроспособной экспериментальной системы эмбриона живой плодовой мухи.
Протокол микроинъекций G-actinRed в живые эмбрионы дрозофилы был первоначально разработан для изучения динамики нормальных цитоплазмических актиновыхструктур 17 во время построения тканей. В этих исследованиях мы обнаружили, что инъекция G-actinRed не оказывает негативного влияния на ранние процессы развития эмбриона, включая цитокинезили гастрипуляцию 17,18. Затем мы изменили протокол, адаптируя обработку эмбриона и G-actinRed инъекции, чтобы изображение актин стержней в тепловой подчеркнул эмбрионов, проходящих ASR1. Другие методы, кроме инъекции G-actinRed, могут быть использованы для визуализации актина в эмбрионах. Эти методы опираются на выражение флуоресцентных белков (FPs) помечены актина или доменов актин связывания белков, таких как Утрофин-мчерри, Lifeact, F-tractin-GFP, и Moesin-GFP (рассмотренв 19). Однако, используя эти FP зонды требует осторожности, потому что они могут стабилизировать или нарушить некоторые актин структуры, не в равной степенимаркировать все актин структуры 20, а в случае актин-GFP, очень переэкспрессированы – проблематично для анализа стержня сборки, которая является не только стресс зависит, но и actin концентрациизависит 1. Таким образом, G-actinRed является предпочтительным зондом для исследования стержня в эмбрионах мух, а большой размер эмбриона позволяет его легко инъекцию.
Рабочий процесс этого протокола похож на другие устоявшиеся методы микроинъекции, которые были использованы для инъекций белков, нуклеиновых кислот, лекарств и флуоресцентных индикаторов в эмбрионы дрозофилы21,22,23,24,25,26,27. Однако, после микроинъекции G-actinRed здесь, эмбрионы подвергаются легкому тепловому стрессу, чтобы вызвать сборку ASR и внутриядерного актина стержня. Для лабораторий с доступом к мухам и инъекционной установке этот метод должен быть легко реализуемым и адаптируемым для конкретных линий исследования в отношении ASR, включая его индукцию различными стрессами или модуляцией в различных генетических фонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значение этого метода заключается втом,что он использует устоявшийся протокол микроинъекции в дрозофила эмбрионов 21,22,23,24,25,26,27, чтобы новые исследования в отно…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью признают работу Лиулиу Чжэна и Цзэнхуэй Сюэ, которые помогли пионером этой техники в лаборатории Sokac, а также Хасана Сидэ, который помог с анализом. Работа по этому исследованию финансируется за счет гранта NIH (R01 GM115111).
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
Referenzen
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Entwicklungsbiologie. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
