Functional Assessment of <em>BRCA1</em> variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Ji-Eun See; Ha Rim Shin; Gayoung Jang; Jiyeon Kweon; Yongsub Kim

doi:10.3791/61557

JoVE Journal > Cancer Research

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Krebsforschung

Funktionsbewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-mediated Base Editors

Published: February 28, 2021

doi:

10.3791/61557

Ji-Eun See², Ha Rim Shin², Gayoung Jang², Jiyeon Kweon², Yongsub Kim²

¹Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center,University of Ulsan College of Medicine, ²Stem Cell Immunomodulation Research Center,University of Ulsan College of Medicine

Summary

Menschen mit BRCA1-Mutationen haben ein höheres Risiko, an Krebs zu erkranken, was eine genaue Bewertung der Funktion von BRCA1-Varianten rechtfertigt. Hierin haben wir ein Protokoll zur funktionellen Bewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditoren beschrieben, die eine gezielte Konvertierung von C:G in T:A in lebenden Zellen ermöglichen.

Abstract

Jüngste Studien haben die Risiken im Zusammenhang mit BRCA1-Genmutationen mit verschiedenen funktionellen Bewertungsmethoden wie fluoreszierenden Reporter-Assays, embryonalen Stammzell-Viability-Assays und therapeutischen medikamentenbasierten Sensitivitätstests untersucht. Obwohl sie viele BRCA1-Varianten geklärt haben, sind diese Assays, die die Verwendung exogen ausgedrückter BRCA1-Varianten beinhalten, mit Überexpressionsproblemen verbunden und können nicht auf posttranskriptionelle Regulierung angewendet werden. Um diese Einschränkungen zu beheben, berichteten wir zuvor über eine Methode zur funktionellen Analyse von BRCA1-Varianten über den CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditor, die eine gezielte Nukleotidsubstitution in lebenden Zellen induzieren. Mit dieser Methode identifizierten wir Varianten, deren Funktionen mehrdeutig bleiben, einschließlich c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T und c.4986+5G>A, und bestätigten, dass CRISPR-vermittelte Basiseditoren nützliche Werkzeuge sind, um die in BRCA1unsicheren Varianten der Bedeutung neu zu klassifizieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur funktionstüchchenanalyse von BRCA1-Varianten mit DEM CRISPR-basierten Cytosin-Basiseditor. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Auswahl von Zielstandorten, die Funktionsanalyse und Bewertung von BRCA1-Varianten.

Introduction

Das Brustkrebstyp-1-Anfälligkeitsgen (BRCA1) ist ein weithin bekanntes Tumorsuppressorgen. Da das BRCA1-Gen mit der Reparatur von DNA-Schäden zusammenhängt, würden Mutationen in diesem Gen zu einem höheren Risiko für die Krebsentwicklung bei einem Individuum führen¹. Brust-, Eierstock-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs sind mit vererbten Funktionsverlustmutationen (LOF) des BRCA1-Gens ²verbunden. Die funktionelle Bewertung und Identifizierung von BRCA1-Varianten kann bei der Prävention und Diagnose der verschiedenen Krankheiten helfen. Um die Funktion von BRCA1-Varianten zu adressieren, wurden verschiedene Methoden entwickelt und breit zur Untersuchung der Pathogenität von BRCA1-Varianten wie embryonalen Stammzell-Viability-Assays, fluoreszierenden Reporter-Assays und therapeutischen drogenbasierten Sensitivitäts-Assays³^,⁴^,⁵^,⁶verwendet. Obwohl diese Methoden die Funktion vieler BRCA1-Varianten bewertet haben, stellen die Methoden mit exogen exogen exzessiv ausgedrückten BRCA1-Varianten Einschränkungen in Bezug auf Überexpression dar, die die nachgelagerte Regulierung, Gendosierung und Proteinfaltung beeinträchtigen könnten⁷. Darüber hinaus können diese Assays nicht auf die posttranskriptionelle Regulierung wie mRNA-Spleißen, Transkriptionstabilität und Wirkung der unübersetzten Region⁸^,⁹genutzt werden.

CRISPR-Cas9 System ermöglicht gezielte Genombearbeitung in lebenden Zellen und Organismen¹⁰. Durch eine Single-Guide-RNA kann Cas9 Doppelstrangbrüche (DSBs) in der chromosomalen DNA an bestimmten genomischen Loci induzieren, um zwei DNA-Reparaturpfade zu aktivieren: fehleranfällige nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und fehlerfreie Homologie-gesteuerte Reparatur (HDR)¹¹. HDR ist ein präziser Reparaturmechanismus; DSBs, die durch Cas9-Nuklease für HDR induziert werden, führen jedoch häufig zu unerwünschter Insertion und Deletion (Indel) Mutation. Darüber hinaus benötigt es homologe Spender-DNA-Vorlagen für die Reparatur von DNA-Schäden und hat eine relativ geringe Effizienz. Kürzlich wurden Cas9-Nickase (nCas9) mit Cytidin-Deaminase-Domänen für die Ausrichtung von C:G bis T:A-Substitutionen verschmolzen, ohne dass homologe DNA-Vorlagen und DNA-Doppelstrangbrüche¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Mit dem Cytosin-Basiseditor haben wir eine neue Methode zur funktionstüchchenden Analyse der BRCA1-Varianten¹⁶entwickelt.

In dieser Studie verwendeten wir CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditor, BE3¹⁴, der effiziente C:G- bis T:A-Punktmutationen induziert, für die Implementierung der funktionellen Bewertung von BRCA1-Varianten und identifizierten erfolgreich die Funktionen mehrerer BRCA1-Varianten (Abbildung 1).

Abbildung 1: Eine Übersicht über den Workflow für die funktionale Bewertung. (A) Schema, das die funktionelle Bewertung von BRCA1zeigt. Da die LOF von BRCA1 die Zelllebensfähigkeit beeinflusst, sterben die Zellen ab, wenn die BRCA1-Mutation pathogen ist, wenn die Durchgangszahl zunimmt. (B) Phasen der funktionellen Bewertung von BRCA1. Gepunktete Box ist optional. Es kann durch Ko-Transfektion von gRNA-Exzess und BE3-exemittiert Erdplasmiden DNA ersetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

HINWEIS: Methode 1 (Erzeugung von HAP1-BE3-Zelllinien) ist optional. Anstatt eine BE3-exemittierende Zelllinie zu konstruieren, kann BE3-kodierende Plasmid-DNA mit gRNA-kodierender Plasmid-DNA kotransfiziert werden. Andere Varianten von Cytosin-Basis-Editoren, wie BE4max, können auch für eine hocheffiziente Basisbearbeitung verwendet werden. 1. Erzeugung von HAP1-BE3-Zelllinien Aufbau von Plasmid-DNA Um die lentiBE3-blast Plasmid-DNA für die Lentivirus-Produktion zu konstr…

Representative Results

Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Ansätze ermöglichen die funktionelle Bewertung endogener BRCA1-Varianten, die von CRISPR-basierten Cytosin-Basiseditoren generiert werden. Um geeignete Zelllinien für die funktionelle Bewertung von BRCA1-Varianten auszuwählen, sollten die Forscher bestätigen, dass BRCA1 ein wesentliches Gen in den Zielzelllinien ist. Zum Beispiel transfizierten wir zuerst Cas9 und gRNAs in HAP1-Zelllinien, um BRCA1 zu stören, und analysierten …

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für funktionale Bewertungen von BRCA1-Varianten mit DEM CRISPR-meditierten Cytosin-Basiseditor. Das Protokoll beschreibt Methoden für die Konstruktion von gRNAs am Zielort und die Konstruktion der Plasmid-DNAs, aus denen sie exprimiert werden. Cytosin-Basis-Editoren induzieren Nukleotid-Konvertierung in einem aktiven Fenster (bei BE3 Nukleotide 4–8 im PAM-distalen Ende der gRNA-Zielsequenzen). Der Forscher sollte sorgfältig Zielsequenzen auswählen, da alle …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea unterstützt (Grants 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 und 2018R1A5A2020732 an Y.K.).

Materials

BamHI	NEB	R3136	Restriction enzyme
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific	A1113903	Drug for selecting transduced cells
BsaI	NEB	R0535	Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Gibco	11965092	Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum	Gibco	16000036	Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium	Gibco	12440046	Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast	Addgene	52962	Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027	Transfection reagent
Opti-MEM	Gibco	31985070	Transfection materials
pCMV-BE3	Addgene	73021	Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140	Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530SQ	High-fidelity polymerase
pMD2.G	Addgene	12259	Plasmids DNA for virus prep.
pRG2	Addgene	104174	gRNA cloning vector
psPAX2	Addgene	12260	Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit	Qiagen	28704	Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I	NEB	M0302	Materials for T7E1 assay
XbaI	NEB	R0145	Restriction enzyme

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Diesen Artikel zitieren

See, J., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).