Functional Assessment of <em>BRCA1</em> variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Ji-Eun See; Ha Rim Shin; Gayoung Jang; Jiyeon Kweon; Yongsub Kim

doi:10.3791/61557

JoVE Journal > Cancer Research

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Krebsforschung

Valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base mediati da CRISPR

Published: February 28, 2021

doi:

10.3791/61557

Ji-Eun See², Ha Rim Shin², Gayoung Jang², Jiyeon Kweon², Yongsub Kim²

¹Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center,University of Ulsan College of Medicine, ²Stem Cell Immunomodulation Research Center,University of Ulsan College of Medicine

Summary

Le persone con mutazioni BRCA1 hanno un rischio più elevato di sviluppare il cancro, il che giustifica una valutazione accurata della funzione delle varianti BRCA1. Nel presente documento, abbiamo descritto un protocollo per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base citosina mediati da CRISPR che consentono la conversione da C:G a T:A mirata nelle celle viventi.

Abstract

Studi recenti hanno studiato i rischi associati alle mutazioni geniche BRCA1 utilizzando vari metodi di valutazione funzionale come test fluorescenti dei reporter, test di vitalità delle cellule staminali embrionali e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci. Sebbene abbiano chiarito molte varianti brca1, questi test che coinvolgono l’uso di varianti BRCA1 espresse esogenamente sono associati a problemi di sovraespressione e non possono essere applicati alla regolamentazione post-trascrizionale. Per risolvere queste limitazioni, abbiamo precedentemente segnalato un metodo per l’analisi funzionale delle varianti BRCA1 tramite l’editor di base di citosina mediato da CRISPR che induce una sostituzione mirata dei nucleotidi nelle cellule viventi. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato varianti le cui funzioni rimangono ambigue, tra cui c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e abbiamo confermato che gli editor di base mediati da CRISPR sono strumenti utili per riclassificare le varianti di significato incerto in BRCA1. Qui, descriviamo un protocollo per l’analisi funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando l’editor di base citosina basato su CRISPR. Questo protocollo fornisce linee guida per la selezione dei siti di destinazione, l’analisi funzionale e la valutazione delle varianti BRCA1.

Introduction

Il gene della suscettibilità al cancro al seno di tipo 1(BRCA1)è un gene soppressore tumorale ampiamente noto. Poiché il gene BRCA1 è correlato alla riparazione del danno al DNA, le mutazioni in questo gene porterebbero a un maggiore rischio di sviluppo del cancro in un^{individuo 1}. I tumori al seno, alle ovaie, alla prostata e al pancreas sono legati a mutazioni ereditarie della perdita di funzione (LOF) del gene BRCA1 ². La valutazione funzionale e l’identificazione delle varianti BRCA1 possono aiutare a prevenire e diagnosticare le varie malattie. Per affrontare la funzione delle varianti BRCA1, sono stati sviluppati diversi metodi e ampiamente utilizzati per indagare la patogenicità delle varianti BRCA1 come test di vitalità delle cellule staminali embrionali, test fluorescenti dei reporter e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci³^,^4,⁵^,⁶. Sebbene questi metodi abbiano valutato la funzione di molte varianti BRCA1, i metodi che coinvolgono varianti BRCA1 espresse esogenamente pongono limitazioni in termini di sovraespressione che potrebbero influenzare la regolazione a valle, il dosaggio genico e il ripiegamento proteico⁷. Inoltre, questi saggi non possono essere sfruttati per la regolazione posttrascrizionale come l’affezione dell’mRNA, la stabilità della trascrizione e l’effetto della regione^{non tradotta 8}^,⁹.

Il sistema CRISPR-Cas9 consente un editing mirato del genoma nelle cellule viventi e negli^{organismi 10}. Attraverso un RNA a guida singola, Cas9 può indurre rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA cromosomico a loci genomici specifici al fine di attivare due percorsi di riparazione del DNA: percorso di terminazione non disomologa (NHEJ) soggetto a errori e percorso di riparazione diretta dall’omologia (HDR) privo di^{errori 11.} L’HDR è un meccanismo di riparazione preciso; tuttavia, i DSB indotti dalla nucleasi Cas9 per HDR spesso si trae da mutazione indesiderata di inserimento ed eliminazione (indele). Inoltre, ha bisogno di modelli di DNA donatori omologhi per riparare i danni al DNA e ha un’efficienza relativamente bassa. Recentemente, la nickasi Cas9 (nCas9) è stata fusa con domini di deaminasi citidina per indirizzare le sostituzioni da C:G a T:A, senza la necessità di modelli di DNA omologhi e rotture a doppio filamento di DNA^12,^13,^14,¹⁵. Utilizzando l’editor di base citosina, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l’analisi funzionale delle varianti BRCA1¹⁶.

In questo studio, abbiamo utilizzato l’editor di base di citosina mediato da CRISPR, BE3¹⁴, che induce mutazioni puntili efficienti da C:G a T:A, per implementare la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 e ha identificato con successo le funzioni di diverse varianti BRCA1 (Figura 1).

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per la valutazione funzionale. (A) Schema che mostra la valutazione funzionale di BRCA1. Poiché l’LOF di BRCA1 influisce sulla vitalità cellulare, quando la mutazione BRCA1 è patogena, le cellule muoiono all’aumentare del numero di passaggi. (B) Fasi della valutazione funzionale della BRCA1. La casella punteggiata è facoltativa. Può essere sostituito dalla co-trasfezione del GRNA che esprime e BE3 che esprime DNA di plasmidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: il metodo 1 (generazione di linee cellulari HAP1-BE3) è facoltativo. Invece di costruire una linea cellulare che esprime BE3, il DNA plasmide codificante BE3 può essere co-trasfetto con DNA plasmide codificante con gRNA. Altre varianti di editor di base citosina, come BE4max, possono anche essere utilizzate per l’editing di base altamente efficiente. 1. Generazione di linee cellulari HAP1-BE3 Costruzione di DNA plasmide Per costruire il DNA plasmide lentiBE3-blast per…

Representative Results

Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la valutazione funzionale delle varianti endogene BRCA1 generate dagli editor di base citosina basati su CRISPR. Per selezionare linee cellulari appropriate per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1, i ricercatori dovrebbero confermare che BRCA1 è un gene essenziale nelle linee cellulari mirate. Ad esempio, abbiamo prima trasfetto Cas9 e gRNA in linee cellulari HAP1 per interrompere BRCA1 e analizzato le freq…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo semplice per le valutazioni funzionali delle varianti BRCA1 utilizzando l’editor di base citosina meditato da CRISPR. Il protocollo descrive i metodi per la progettazione di gRNA al locus bersaglio e la costruzione dei DNA plasmidici da cui sono espressi. Gli editor di base citosina inducono la conversione nucleotidica in una finestra attiva (nel caso di BE3, nucleotidi 4-8 nell’estremità pam-distale delle sequenze bersaglio del gRNA). Il ricercatore dovrebbe scegliere atten…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea (sovvenzioni 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 e 2018R1A5A2020732 a Y.K.).

Materials

BamHI	NEB	R3136	Restriction enzyme
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific	A1113903	Drug for selecting transduced cells
BsaI	NEB	R0535	Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Gibco	11965092	Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum	Gibco	16000036	Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium	Gibco	12440046	Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast	Addgene	52962	Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027	Transfection reagent
Opti-MEM	Gibco	31985070	Transfection materials
pCMV-BE3	Addgene	73021	Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140	Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530SQ	High-fidelity polymerase
pMD2.G	Addgene	12259	Plasmids DNA for virus prep.
pRG2	Addgene	104174	gRNA cloning vector
psPAX2	Addgene	12260	Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit	Qiagen	28704	Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I	NEB	M0302	Materials for T7E1 assay
XbaI	NEB	R0145	Restriction enzyme

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Diesen Artikel zitieren

See, J., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).