הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.
Abstract
Bioprinting מתגלה ככלי מבטיח לפברק מודלים של סרטן אנושי 3D כי טוב יותר לסכם סימני ההיכר הקריטיים של ארכיטקטורת רקמת vivo. בהדפסה ביולוגית של שחול שכבה אחר שכבה, תאים בודדים מובלטים בביו-ינק יחד עם רמזים מרחביים וטמפורליים מורכבים לקידום הרכבה עצמית של רקמות היררכיות. עם זאת, טכניקה זו biofabrication מסתמך על אינטראקציות מורכבות בין תאים, bioinks ורמזים ביוכימיים וביופיזיים. לכן, הרכבה עצמית עשויה להימשך ימים או אפילו שבועות, עשויה לדרוש bioinks ספציפי, ולא תמיד יכול להתרחש כאשר יש יותר מסוג תא אחד מעורב. לכן פיתחנו טכניקה להדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידים אפיתל שד תלת-ממדיים שנוצרו מראש במגוון ביו-לינקים. ספירואידים אפיתל שד 3D מעוצבים מראש קיימו את הכדאיות שלהם ואת הארכיטקטורה המקוטבת לאחר ההדפסה. בנוסף הדפסנו את הכדורואידים בתלת-ממד על רשתות תאי אנדותל של כלי הדם כדי ליצור מודל של תרבות משותפת. לכן, טכניקת ההדפסה הביולוגית החדשה יוצרת במהירות מודל שד אנושי תלת מימדי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בעלות נמוכה יותר ועם גמישות גבוהה יותר מאשר טכניקות הדפסה ביולוגית מסורתיות. טכניקת ביו-הדפסה רב-תכליתית זו ניתנת להדפסה כדי ליצור מודלים תלת-ממדיים של רקמות אחרות בביו-ינקים נוספים.
Introduction
מודלים של גידולים במבחנה במבחנה הם כלים חיוניים למחקר מכני של צמיחת סרטן וגרורות. עבור סרטן השד בפרט, תאי אפיתל השד בתרבית Matrigel לארגן לתוך ספרואידים מקוטבים הדומים יותר לארכיטקטורה acinus ממארי in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. 3D תרבית תאי אפיתל השד משפיע גם על תפקוד התא, עם תרביות 3D מראה הבדלים אפנון קולטן אפידרמיס (EGF)8,9; פונקציית אונקוגן, כולל ErbB210; צמיחה ואפופטוזיס איתות11,12; והתנגדותכימותרפית 13,14. תאי אנדותל כלי דם מגיבים באופן דומה באופן שונה לגירויים סביבתיים בתלת מימד לעומת תרבות דו מימדית מסורתית15,16,17,18. עם זאת, רוב ההבנה של אינטראקציות אנדותל ושד כלי הדם אפיתל מגיע תרבות 2D באמצעות בינוני מותנה או Transwell מוסיף, או מודלים 3D שבו שני סוגי התאים מופרדים פיזית19,20,21,22,23. מודלים אלה של תרבות משותפת מספקים תובנה פיזיולוגית מוגבלת, שכן הן תרבות 3D והן מגע תאים הם קריטיים אנדותל כלי הדם – אינטראקציות תא אפיתל השד24,25,26.
מודלים סרטן 3D כבר מפוברק באמצעות מגוון רחב של טכניקות, כולל היווצרות ספירואיד טיפה תלויה, bioprinting, הרכבה מגנטית, ותרבות בתוך הידרוג’לים או על פיגומים מהונדסים5,27,28,29. לאחרונה, מודלים גידול 3D נוצרו עם סוגי תאים מרובים מסודרים במבנים 3D בהתאמה שלהם. בדוגמה אחת של פלטפורמת גידול על שבב, סרטן, אנדותל, תאים סטרומה היו מעורבבים לתוך מטריצה ולאחר מכן מוזרק לתוך שלושת תאי הרקמה המרכזיים במכשיר polydimethylsiloxane (PDMS). תאי הרקמה היו גובלים בשני ערוצים חוץים שייצגו עורק ונוזל. לאחר 5-7 ימים של תרבות, תאי אנדותל יצרו רשת microvascular ותאי סרטן התפשטו כדי ליצור גידולים קטנים ליד כלי הדם. פלטפורמה זו שימשה אז כדי לסנן סמים ושילובי סמים30. פלטפורמות נוספות לגידול על שבב נוצרו כדי לחקור גרורות וסוגי סרטן עם גירויים מכניים ספציפיים (למשל, זן מכני בריאה)31,32. עם זאת, פלטפורמות אלה בדרך כלל אינן כוללות הן כלי דם וסרטן במבנים 3D בהתאמה שלהם.
Biofabrication מראה הבטחה גדולה בקידום 3D במודלים גידולים במבחנה כלי דם, שכן הוא מאפשר שליטה מרחבית הדוקה על מיקום התא. למרות הצמיחה של bioprinting בעשור האחרון, מחקרים מעטים להתמקד במיוחד על גידולים33,34. בדוגמה אחת, הדפסה תלת מימדית של תאי HeLa בהידרוגל ג’לטין/אלגינט/פיברינוגן שימשה ליצירת מודל סרטן צוואר הרחם במבחנה. תאים סרטניים הודפסו ביולוגית כתאים בודדים ולאחר מכן הורשו ליצור ספרואידים, אשר הראו קצב התפשטות גבוה יותר, ביטוי מטאלופרוטאינאז מטריצה מוגברת, ו chemoresistance גבוה יותר מאשר תאים בתרבות 2D35. במחקרים אלה, כמו רבים אחרים36,37, השעיות תאים מנותקים הודפסו ביולוגית, ולאחר מכן תרביות התא סופקו עם רמזים מכניים וביוכימיים הנדרשים כדי לאפשר לתאים ליצור מבנה 3D. עם זאת, הרכבה עצמית תאית עשויה להימשך ימים או שבועות, עשויה לדרוש רמזים סביבתיים מרחביים וטמפורליים מורכבים, או לא להתרחש כאשר שני סוגי תאים הם תרבית משותפת. לדוגמה, תאי אפיתל השד גרמו למוות תאי בתאי אנדותל בתרבית דו-ממדית, ותאי אפיתל שד מנותקים לא נוצרו כדוריות תלת-ממדיות כאשר הודפסו ביולוגית באלגינאט/ג’לטין הידרוג’ל38. אפיתל שד מנותק או תאים סרטניים יצרו ספרואידים בביוינקים מבוססי אלגינט רק כאשר נלכדו בתבניות PDMS עגולות. במקרים אחרים, spheroids נוצרו באמצעות טיפות מושעה בלוחות באר עגולים מצורף אולטרה נמוך ולאחר מכן מעורבב לתוך bioinks מבוסס אלגינט39,40.
כעת אנו מתארים שיטה חלופית 3D רקמה biomanufacturing בפרוטוקול זה. במקום לזרוע תאים מנותקים ולחכות שתאים אלה ייצרו את המבנים תלת-ממדיים, אנו מתארים כיצד ליצור ולהדפיס ביולוגית ספרואידים של גידולים תלת-ממדיים ברשת צינור כלי דם כדי ליצור מודל תרבות-שיתוף גידולים שניתן להשתמש בו כמעט מיד. ניתן לגדל ספרואידים של גידולים במבחנה או להפיקם מרקמות אנושיות (אורגנואידים). באופן דומה, צינורות כלי דם ניתן לגדל או יכול להיגזר שברים microvascular רקמת שומן. Bioinks יכול לנוע בין אלגינט פעיל ביולוגית כדי Matrigel פעיל מאוד ביולוגית41. מאז מודל זה 3D גידול שיתוף תרבות יכול להיווצר עם מגוון רחב של מבני תאים bioinks, זה יכול לשלב סוגי תאים מרובים, מטריצות חוץ תאיות, ומדרגי כימוקין15,42. בעוד בניסוח הנוכחי שלה, רשתות אנדותל לא ניתן לחדור, איטרציות עתידיות יכול לשלב שיטה זו עם microfluids או על שבב מערכות. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל שד תלת מימדי על רשתות אנדותל מאפשרת ביופבריציה מהירה של מודלים של השד האנושי לבדיקות סמים ורפואה מדויקת מותאמת אישית27.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו להדפסה ביולוגית של ספרואידים בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם לתרבות משותפת עם תאי אנדותל גם בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם. צעדי פרוטוקול קריטיים כוללים היווצרות ראשונית של ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC. יש לנקוט משנה זהירות בהאכלת ספירואידים אפיתל, שכן הם מופרעים בקלו?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי NIH 1R01HL140239-01 ל- AMC. ברצוננו להודות למרכז להדמיית תאים באוניברסיטת דרקסל.
Materials
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block – Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel – growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| >Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
Referenzen
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
- Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, 1945-1957 (1995).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
- Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, 2377-2388 (2003).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
- Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
- Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
- Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), 1068-1078 (2015).
- Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
- Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), 1262-1271 (2013).
- Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
- Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
- Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
- Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
- Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
- Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
- Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
- Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
- Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
- Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
- Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
- Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
