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Biotechnik

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

Published: November 02, 2020
doi:
10.3791/61791
,
1Department of Biology,Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering,University of Maryland

Summary

이 프로토콜의 목표는 약물 선별 연구에 사용될 수 있는 3D 유방 내피 상양 모델을 빠르게 만들기 위해 사전 형성된 내피 네트워크에 다세포 스페로이드로서 유방 상피 세포를 직접 바이오프린트하는 것입니다.

Abstract

바이오 프린팅은 생체 내 조직 아키텍처의 중요한 특징을 더 잘 재현하는 3D 인간 암 모델을 조작하는 유망한 도구로 부상하고 있습니다. 현재 층별 압출 바이오프린팅에서 개별 세포는 복잡한 공간 및 측두구 큐와 함께 바이오잉크에서 압출되어 계층 적 조직 자체 조립을 촉진합니다. 그러나, 이 생화 기술은 세포 사이 복잡한 상호 작용에 의존합니다, 생잉크 및 생화학및 생생물물리학 단서. 따라서, 자체 조립은 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있으며, 특정 바이오잉크가 필요할 수 있으며, 하나 이상의 세포 유형이 관련될 때 항상 발생하지 않을 수 있다. 따라서 우리는 다양한 바이오 잉크에서 미리 형성된 3D 유방 상피 스페로이드를 직접 바이오 프린트하는 기술을 개발했습니다. 생체 인쇄 사전 형성 된 3D 유방 상피 스페로이드는 인쇄 후 생존력과 편광 아키텍처를 유지했습니다. 우리는 또한 공동 배양 모델을 만들기 위해 혈관 내피 세포 네트워크에 3D 스페로이드를 인쇄했습니다. 따라서, 새로운 바이오 프린팅 기술은 기존의 바이오 프린팅 기술보다 더 낮은 비용으로 더 높은 유연성으로 생리적으로 관련된 3D 인간 유방 모델을 빠르게 만듭니다. 이 다목적 바이오 프린팅 기술은 추가 바이오 잉크에서 다른 조직의 3D 모델을 생성하기 위해 추정 될 수있다.

Introduction

체외 혈관 종양 모델의 3D는 암 성장과 전이에 대한 기계론적 연구를 위한 필수 도구입니다. 특히 유방암의 경우, Matrigel에서 배양된 유방 상피 세포는 생체 내 유방 아시누스 건축1,2,3,4,5,6,7,8과더 가깝게 유사한 편광 스페로이드로구성된다. 3D 유방 상피 세포 배양또한 세포 기능에 영향을 미치며, 표피 성장 인자(EGF) 수용체 변조8,9의차이를 나타내는 3D 배양; ErbB210을포함하는 종양유전자 기능; 성장 및 세포사멸 신호11,12; 및 화학 요법 저항13,14. 혈관 내피 세포는 3D 대전통적인 2D 배양(15,16,17,18)에서환경 자극에 유사하게 반응한다. 그러나, 혈관 내피 및 유방 상피 상호 작용의 이해의 대부분은 조건부 배지 또는 트랜스웰 삽입을 사용하여 2D 배양에서 비롯되거나, 2개의 세포 유형이 물리적으로 분리되는 3D모델(19,20,21,22, 23)에서 비롯된다. 이러한 공동 배양 모델은 3D 배양과 세포 접촉이 혈관 내피-유방 상피 세포 상호 작용24,25,26에매우 중요하기 때문에 제한된 생리적 통찰력을 제공한다.

3D 암 모델은 하이드로겔 내 또는 엔지니어링 스캐폴드5,27, 28,29에매달려 방울 스페로이드 형성, 바이오 프린팅, 자기 조립 및 배양을 포함한 다양한 기술을 사용하여 제조되었다. 최근에는 3D 종양 모델이 각각의 3D 구조에 배치된 다중 세포 유형으로 만들어졌습니다. 종양-온-a-칩 플랫폼의 한 예에서, 암, 내피 및 기질 세포는 매트릭스로 혼합된 다음 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치에서 3개의 중앙 조직 챔버로 주입하였다. 조직 챔버는 동맥과 정맥을 나타내는 두 개의 외부 채널에 의해 경계되었다. 배양 5-7일 후, 내피 세포는 혈관망을 형성하고 암세포가 증식하여 혈관 근처에서 작은 종양을 형성하였다. 이 플랫폼은 약물 및 약물 조합30을검사하는 데 사용되었다. 추가 종양-온-a-칩 플랫폼은 특정 기계적 자극(예를 들어, 폐내의 기계적 변형)을 갖는 전이 및 암 유형을 연구하기 위해만들어졌으며(예를 들어, 폐내의 기계적 변형)31,32. 그러나, 이들 플랫폼은 일반적으로 각각의 3D 구조에 혈관과 암을 모두 포함하지 않는다.

생체 제작은 세포 위치에 대한 단단한 공간 제어를 가능하게 하기 때문에 체외 혈관 종양 모델에서 3D를 진행하는 데 큰 약속을 보여줍니다. 지난 10 년 동안 바이오 프린팅의 성장에도 불구하고, 몇몇 연구 결과는종양33,34에특히 집중합니다. 일 예에서, 젤라틴/알지네이트/피브리노겐 하이드로겔에서 HeLa 세포의 3D 프린팅은 체외 자궁 경부암 모델을 만드는 데 사용되었다. 종양 세포는 개별 세포로서 생보화된 다음 스페로이드를 형성할 수 있었는데, 이는 더 높은 증식율, 증가된 매트릭스 메탈로프로틴아제 발현, 그리고 2D배양35에서세포에 비해 더 높은 화학저항성을 보였다. 이러한 연구에서는, 다른 많은36,37,해리된 세포 현탁액이 생체 인쇄되었고, 그 후 세포 배양은 세포가 3D 구조를 형성할 수 있도록 필요한 기계적 및 생화학적 단서를 제공하였다. 그러나, 세포 자체 조립은 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있고, 복잡한 공간 및 현세적 환경 단서를 요구할 수 있거나, 2개의 세포 모형이 공동 배양될 때 생기지 않을 수 있다. 예를 들어, 유방 상피 세포는 2D 공동 배양에서 내피 세포에서 세포 사멸을 유도하고, 해리된 유방 상피 세포는 alginate/젤라틴하이드로겔(38)에서생체 인쇄시 3D 스페로이드를 형성하지 않았다. 분리된 유방 상피 또는 암세포는 원형 PDMS 금형에 갇혀있을 때만 알기네이트 기반 바이오 잉크에서 스페로이드를 형성했습니다. 다른 경우에는, 스페로이드는 초저 부착 원형 웰 플레이트에서 일시 중단 된 방울을 사용하여 형성된 다음 알기네이트 기반 바이오 잉크(39,40)로혼합되었다.

우리는 지금 이 프로토콜에 있는 대안 3D 조직 생물학 제조 방법을 기술합니다. 종자 해리 된 세포를 보고 이러한 세포가 3D 구조를 형성할 때까지 기다리는 대신, 혈관 관 네트워크에 3D 종양 스페로이드를 생성하고 생체 인쇄하는 방법을 설명하여 거의 즉시 사용할 수 있는 종양 공동 배양 모델을 만듭니다. 종양 스페로이드는 체외에서 재배되거나 인간 조직 (organoids)에서 파생 될 수 있습니다. 유사하게, 혈관 관은 성장될 수 있고 지방 조직 미세 혈관 단편에서 파생될 수 있다. 바이오 잉크는 생물학적으로 비활성 알긴산에서 생물학적으로 활동적인마모겔(41)까지다양할 수 있다. 이러한 3D 종양 공동 배양 모델은 다양한 세포 구조 및 바이오 잉크로 생성될 수 있기 때문에 다세포 유형, 세포외 행렬 및 케모킨그라데이션(15,42)을통합할 수 있다. 현재 제형에서 내피 네트워크를 포함할 수는 없지만 향후 반복은 이 방법을 미세유체 또는 -온칩 시스템과 통합할 수 있습니다. 내피 네트워크에 바이오프린팅 3D 유방 상피 스페로이드를 심도 네트워크에 심상검사하여 약물 검사 및 맞춤형 정밀의학(27)을위한 인간 유방 모델의 신속한 생체 제작을 가능하게 한다.

Protocol

1. 유방 상피 세포 성장 및 분석 미디어 MCF10A 유방 상피 세포참고: 비종양 불멸의 유방 상피 세포주는 섬유성질환(43)을가진 환자로부터 유래된다. 세포는 에스트로겐 수용체를 발현하지 않습니다. 20 μg/mL 표피 성장 인자(EGF)를 준비하려면, 200 μg/mL EGF를 만들기 위해 멸균 dH2O의 500 μL에서 lyophilized EGF의 100 μg를 용해하십시오. 20μg/mL EGF의 500 μL을 dH2</sub…

Representative Results

유방 상피 세포는 매트릭스 용액과 2 % 매트릭스 용액을 가진 배양 배지에서 5-8 일 간의 배양 후 3D 스페로이드로 자가 구성해야합니다. 비종양 MCF10A 유방 상피 스페로이드는 둥근 나타나고 속이 빈 중심을 가져야 하며, 인테그린 α6는 스페로이드의 바깥쪽 가장자리로 편광되어야한다(도 1,중공 센터는 빈 중심을 나타낸다). 고도로 침습적인 MDA-MB-231 유방암 상피 세포는 불규?…

Discussion

이 프로토콜은 3D 아키텍처에서도 내피 세포와 공동 배양을 위한 3D 아키텍처에서 바이오 프린트 스페로이드를 바이오프린트하는 최초의 프로토콜입니다. 중요한 프로토콜 단계는 유방 상피 스페로이드 및 HUVEC 네트워크의 초기 형성을 포함합니다. 그들은 쉽게 매트릭스 솔루션에서 중단으로, 유방 상피 스페로이드를 공급에 극단적 인주의를 취해야한다. 마찬가지로, 유방 상피 스페로이드는 매?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NiH 1R01HL140239-01에 의해 AMC에 투자되었습니다. 드렉셀 대학의 세포 이미징 센터에 감사드립니다.

Materials

37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity Sanyo MCO-20AIC Cell incubation
3D Bio printer custom-made None Used for bioprinting
8-well chamber slides VWR, Radnor, PA 53106-306 for seeding spheroids
25-gauge needle Sigma, St. Louis, MO Z192406-100EA bioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof ) Sigma, St.Louis, MO E7023-500ML reconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115006020 secondary block – Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200) Thermo Fisher, Waltham, MA A-11006 Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulin Sigma, St.Louis, MO I-035-0.5ML MCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA) Sigma, St.Louis, MO A2153-500G Blocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning, Corning, NY 352350 Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX Dye Thermo Fisher, Waltham, MA C34552 pre-stain for HUVEC tubes
Compact Centrifuge Hermle- Labnet, Edison ,NJ Z206A For cell centrifugations
Cholera Toxin Sigma, St.Louis, MO C8052-.5MG MCF10A Media additive
Conical tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 62406-200 Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counter Thermo Fisher, Waltham, MA AMQAF1000 counting cells
Glass pipettes (10 mL) VWR, Radnor, PA 76184-746 cell resuspension
DMEM F:12 Thermo Fisher, Waltham, MA 11320033 MCF10A basal media
DMEM 1X VWR, Radnor, PA 10-014-CV MDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza, Durham, NC CC-3156 HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Lonza, Durham, NC CC-3162 Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 Phalloidin Thermo Fisher, Waltham, MA Labelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serum Cytiva, Logan, UT SH30071.03 HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16210064 Live and dead cell stain assay for cell viability
Glycine Sigma, St.Louis, MO G8898-500G immunofluorescence buffer component
Hoescht 33342 Thermo Fisher, Waltham, MA 62249 Nuclei stain immunofluorescence
Horse Serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16050130 MCF10A Media additive
Hydrocortisone Sigma, St.Louis, MO H0888-5G MCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) Cell applications, San Diego , CA 200-05f Endothelial cell lines
Integrin α6 Millipore, Billerica, MA MAB1378 Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assay Thermo Fisher, Waltham, MA L3224 Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscope Zeiss, Thornwood, NY Used to visualize cells
Matrigel – growth factor reduced 10 mg/ml VWR, Radnor, PA 354230 Spheroid formation
MCF10A cells ATCC CRL-10317 Breast cell line
MDA-MB-231 cells ATCC HTB-26 Breast cell line
Paraformaldehyde Sigma, St.Louis, MO 158127-500G cell fixative
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher, Waltham, MA 15140122 MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) Thermo Fisher, Waltham, MA 7001106 Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10X Thermo Fisher, Waltham, MA AM9625 immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifade Thermo Fisher, Waltham, MA P36934 immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF Peprotech, Rocky Hill, NJ AF-100-15 MCF10A/ assay media component
Sodium Azide Sigma, St.Louis, MO S2002-25G immunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL) VWR, Radnor, PA 75846-757 bioprinting process
Tissue culture dish (10cm) VWR, Radnor, PA 25382-166 monolayer cell culture
Triton X-100 Sigma, St.Louis, MO T8787-250ML immunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4% Thermo Fisher, Waltham, MA 15250061 cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher, Waltham, MA 25300054 cell detachment
Tween -20 Thermo Fisher, Waltham, MA 85113 immunofluorescence buffer component
>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) Peprotech, Rocky Hill, NJ 100-20 HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging software PerkinElmer, Hopkinton, MA Z stack compresser
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Referenzen

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Keywords: 3D BioprintingBreast SpheroidsEndothelial NetworksMulticellular ModelsPrecision Medicine3D Cell CultureMCF 10A CellsHUVECCell TrackingMatrix CoatingCell ResuspensionCell Culture Protocols
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Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks. J. Vis. Exp. (165), e61791, doi:10.3791/61791 (2020).
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