Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.
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Methodenartikel
Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bioprinting entwickelt sich zu einem vielversprechenden Werkzeug, um 3D-Humankrebsmodelle herzustellen, die kritische Merkmale der In-vivo-Gewebearchitektur besser rekapitulieren. Beim aktuellen Schicht-für-Schicht-Extrusionsbioprinting werden einzelne Zellen in einem Bioink zusammen mit komplexen räumlichen und zeitlichen Hinweisen extrudiert, um die hierarchische Gewebeselbstmontage zu fördern. Diese Biofabrikationstechnik beruht jedoch auf komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Bioinken und biochemischen und biophysikalischen Hinweisen. Daher kann die Selbstmontage Tage oder sogar Wochen dauern, kann bestimmte Bioinks erfordern und kann nicht immer auftreten, wenn mehr als ein Zelltyp beteiligt ist. Deshalb haben wir eine Technik entwickelt, um vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride in einer Vielzahl von Bioinks direkt zu bioprinten. Biobedruckte vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride hielten ihre Lebensfähigkeit aufrecht und polarisierten die Architektur nach dem Druck. Zusätzlich haben wir die 3D-Sphäroide auf vaskuläre Endothelzellnetzwerke gedruckt, um ein Co-Kultur-Modell zu erstellen. So schafft die neuartige Bioprinting-Technik schnell ein physiologisch relevanteres 3D-Brustmodell zu geringeren Kosten und mit einer höheren Flexibilität als herkömmliche Bioprinting-Techniken. Diese vielseitige Bioprinting-Technik kann extrapoliert werden, um 3D-Modelle anderer Gewebe in zusätzlichen Bioinks zu erstellen.
Einleitung
3D-in-vitro-vaskularisierte Tumormodelle sind wesentliche Werkzeuge für die mechanistische Untersuchung von Krebswachstum und Metastasen. Insbesondere bei Brustkrebs organisieren sich in Matrigel kultivierte Brustepithelzellen zu polarisierten Sphäroiden, die eher der in vivo-Mamma-Akuinusarchitektur1,2,3,4,5,6,7,8ähneln. 3D-Brustepithelzellkultur wirkt sich auch auf die Zellfunktion aus, wobei 3D-Kultur....
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Protokoll
1. Brustepithelzellwachstum und Assay-Medien
- MCF10A Brustepithelzellen
HINWEIS: Die nicht-tumorigenic verewigte Brustepithelzelllinie wird von einem Patienten mit fibrozystischer Erkrankungabgeleitet 43. Zellen drücken keinen Östrogenrezeptor aus.- Um den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) von 20 g/ml vorzubereiten, lösen Sie 100 g lyophilisierten EGF in 500 l sterilen dH2O auf, um 200 g/ml EGF zu bilden. Fügen Sie 500 l von 200 g/ml EGF in 4,5 ml sterile 0,1% BSA in dH2O hinzu, um eine EGF-Lagerlösung mit 20 sg/ml herzustellen. Vorbereitete 20 g/ml EGF-Aliquots bei -20 °C für bis zu 12 Monate lagern.
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Ergebnisse
Brustepithelzellen sollten sich nach 5-8 Tagen Kultur auf Matrixlösung und im Kulturmedium mit 2% Matrixlösung selbst in 3D-Sphäroide organisieren. Nicht-tumorigene MCF10A Brustepithelialsphäride sollten rund erscheinen und ein hohles Zentrum haben, mit Integrin 6 polarisiert bis zum äußeren Rand des Sphäroids(Abbildung 1, Einschub zeigt Hohlzentren). Hochinvasive MDA-MB-231 Brustkrebs-Epithelzellen bilden unregelmäßige Sphäroide. Sphäroide sollten verwendet werden, wenn sie einen Durchmesse.......
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Diskussion
Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Sphäroide in ihrer 3D-Architektur für die Co-Kultur mit Endothelzellen auch in ihrer 3D-Architektur bioprintiert. Kritische Protokollschritte umfassen die Erstbildung von Brustepithelialsphäroiden und HUVEC-Netzwerken. Bei der Fütterung von Epithelsphäroiden ist äußerste Vorsicht geboten, da sie leicht von der Matrixlösung gestört werden können. Ebenso müssen Brustepithelilesphäroide mit Vorsicht behandelt werden, wenn sie von der Matrixlösung abgeführt und in die Netzwerke .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von NIH 1R01HL140239-01 an AMC finanziert. Wir bedanken uns beim Cell Imaging Center der Drexel University.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 37°; C-Inkubator, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit | Sanyo | MCO-20AIC | Zellinkubation |
| 3D-Biodrucker | nach Maß | Keine | Wird für das Bioprinting |
| verwendet 8-Well-Kammerobjektträger | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | für die Aussaat von Sphäroiden |
| 25-Gauge-Nadel | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | Bioprinting-Spritzennadel |
| Absolutes Ethanol (200 proof) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | Rekonstitution von Medienkomponenten |
| Affinipure F(ab′)2-Fragment-Anti-Maus-IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | Sekundärblock - Immunfluoreszenz |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday-Antikörper-Immunfluoreszenz |
| Rinderinsulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0,5ML | MCF10A Medienzusatz |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blockierungsmittel -Immunfluoreszenz |
| Falcon 70 & micro; m Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Entfernen Sie große oder gehäufte Sphäroide |
| CellTracker™ Roter CMTPX Farbstoff | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | Vorfärbung für HUVEC-Röhrchen |
| Kompakte Zentrifuge | Hermle-Labnet, Edison ,NJ | Z206A | Für Zellzentrifugationen |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Medienadditiv |
| Konische Röhrchen 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Sammeln und Resuspendieren von Zellen |
| Countess II-FL Zellzähler | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | Zählzellen |
| Glaspipetten (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | Zellresuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A Basalmedium |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 Basalmedium |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC Basalmedium |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Begleitet von einem Bulletkit (mit Wachstumsfaktoren) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Markierung MDA-MB-231 Sphäroide | |
| Fötales Rinderserum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 Medienadditiv |
| Ziegenserum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunfluoreszenzmarkierungskomponente |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | Immunfluoreszenzpufferkomponente |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Immunfluoreszenz-Pferdeserum |
| Kerne | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Medienadditiv |
| Hydrocortison | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Medienadditiv |
| Endothelzellen (HUVECs) Humane Umblische Venen-Endothelzellen (HUVECs) | Zellanwendungen, San Diego , CA | 200-05f | Endothelzelllinien |
| Integrin & Alpha; 6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunfluoreszenz-Sphäroid-Markierungskomponente |
| Lebend-Assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Lebend- und Totzell-Färbungsassay für die Zellviabilität |
| LSM 700 Konfokalmikroskop | Zeiss, Thornwood, NY | Wird zur Visualisierung von Zellen verwendet | |
| Matrigel - Wachstumsfaktor reduziert 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Sphäroid Bildung |
| MCF10A-Zellen | ATCC | CRL-10317 | Brustzelllinie |
| MDA-MB-231 Zellen | ATCC | HTB-26 | Brustzelllinie |
| Paraformaldehyd | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | Zellfixiermittel |
| Penicillin und Streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Medienzusatz |
| Phosphat gepuffert Kochsalzlösung 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Waschpuffer für Zellen vor der Trypsinisierung |
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | Immunfluoreszenzpufferkomponente |
| Prolong Gold | Antifade Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | Immunfluoreszenz-Eindeckmittel |
| Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ Assay-Medienkomponente |
| Natriumazid | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | Immunfluoreszenzpufferkomponente |
| Sterile Spritze (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | Bioprinting-Verfahren |
| Gewebekulturschale (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | Monolayer-Zellkultur |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | Immunfluoreszenzpufferkomponente |
| Trypanblau 0,4 % | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | Zellzähleradditiv |
| Trypsin-EDTA 0,05 % | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | Zellablösung |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | Immunfluoreszenzpufferkomponente |
| Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC-Röhrenadditiv |
| Volocity 6.3 Software für die Zellbildgebung | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z-Stapelkomprimierer |
Referenzen
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
