פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).
החברה המזדקנת יותר ויותר שלנו מובילה לשכיחות גוברת של מחלות נוירודגנרטיביות. עד כה, המנגנונים הפתולוגיים אינם מובנים כראוי, ובכך מעכבים את כינונתם של טיפולים מוגדרים. טיפולים גנטיים מוספים מבוססי תאים לביטוי מוגבר של גורם מגן נחשבים כאופציה מבטיחה לטיפול תרופתי במחלות נוירודגנרטיביות, כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). פיתחנו שיטה לביטוי יציב של הגורם הנגזר מאפיתל פיגמנטי (PEDF), המאופיין כחלבון נוירו-פרוטקטיבי ואנטי-אנגיוגני במערכת העצבים, לתוך הגנום של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). תאי PE ראשוניים בודדו מעיני תורמים אנושיים ונשמרו בתרבית. לאחר שהגיעו למפגש, 1 x 104 תאים הושעו ב-11 μL של מאגר resuspension ובשילוב עם 2 μL של תמיסה מטוהרת המכילה 30 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזן היפראקטיבי (SB100X) ו-470 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF. השינוי הגנטי בוצע עם מערכת אלקטרופורציה נימית באמצעות הפרמטרים הבאים: שתי פולסים עם מתח של 1,100 V ורוחב של 20 ms. תאים שעברו טרנספקציה הועברו לצלחות תרבית המכילות תוסף בינוני עם סרום בקר עוברי; אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה נוספו עם חילופי המדיום הראשונים. העברה מוצלחת הודגמה בניסויים שבוצעו באופן עצמאי. תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) הראתה את הביטוי המוגבר של טרנסגן PEDF. הפרשת ה-PEDF הייתה גבוהה באופן משמעותי ונותרה יציבה, כפי שהוערך על ידי אימונובלוטציה, וכומתה על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA). העברה בתיווך SB100X אפשרה אינטגרציה יציבה של גן PEDF בגנום של תאי PE והבטיחה הפרשה מתמשכת של PEDF, שהיא קריטית לפיתוח טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות אחרות ברשתית. יתר על כן, ניתוח פרופיל האינטגרציה של טרנספוזון PEDF לתאי PE אנושיים הצביע על התפלגות גנומית כמעט אקראית.
גיל מתקדם מתואר כסיכון העיקרי למחלות נוירודגנרטיביות. ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית המובילה לאובדן ראייה חמור בחולים מעל גיל 60, שייך לארבעת הגורמים השכיחים ביותר לעיוורון ולפגיעה בראייה1 וצפוי לעלות ל -288 מיליון איש בשנת 20402. תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), שכבה אחת של תאים ארוזים היטב הממוקם בין choriocapillaris לבין photoreceptors הרשתית, לתרום פתוגנזה של AMD. ה- RPE ממלא משימות מרובות החיוניות לתפקוד רשתית תקין3 ומפריש מגוון גורמי גדילה וגורמים חיוניים לשמירה על השלמות המבנית של הרשתית והכוריוקפילריס, ובכך תומך בהישרדות הפוטורצפטור ומספק בסיס למחזור הדם ולאספקת חומרים מזינים.
בעיניים בריאות, גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) אחראי לאיזון ההשפעות של גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) ומגן על תאי עצב מפני אפופטוזיס, מונע שגשוג תאי אנדותל ומייצב את האנדותל הנימי. יחס VEGF-to-PEDF קשור לניאו-וסקולריזציה של העין, אשר נצפתה במודלים של בעלי חיים 4,5 וכן בדגימות של חולים עם ניאו-וסקולריזציה כורואידלית (CNV) עקב AMD ורטינופתיה סוכרתית שגשוג 6,7,8,9,10 . ריכוז ה-VEGF המשופר הוא היעד לטיפול הסטנדרטי הנוכחי. התרופות נגד VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ולאחרונה, brolucizumab לשפר את חדות הראייה בכשליש מחולי CNV או ליתר דיוק לייצב את הראייה ב 90% מהמקרים11,12,13. עם זאת, הזריקות התוך-גופיות התכופות, לעתים קרובות חודשיות, נושאות בסיכון לתופעות לוואי14, פוגעות בציות המטופלים ומהוות נטל כלכלי משמעותי על מערכות הבריאות15. יתר על כן, אחוז מסוים מהחולים (2%-20%) אינם מגיבים או רק מגיבים בצורה גרועה לטיפול נגד VEGF16,17,18,19. מקבילות שליליות אלה מחייבות פיתוח של טיפולים אלטרנטיביים, כגון שתלים תוך עיניים, גישות טיפוליות בתאים ו/או בגנים.
הריפוי הגנטי התפתח כטיפול מבטיח במחלות תורשתיות ולא תורשתיות ומתכוון לשחזר רצפי גנים לא מתפקדים או לדכא תקלות. עבור מחלות פוליגניות, שבהן זיהוי והחלפה של הגורמים הסיבתיים כמעט ואינו אפשרי, אסטרטגיות שואפות לאספקה רציפה של גורם מגן. במקרה של AMD, פותחו טיפולים מוספים שונים, כגון הביטוי היציב של אנדוסטטין ואנגיוסטטין 20, אנטגוניסט VEGF מסיס דמוי טירוזין קינאז-1 (sFLT-1)21,22, אשכול החלבון הרגולטורי המשלים של התמיינות 59 (CD59)23 או PEDF 24,25 . העין, ובמיוחד הרשתית, היא מטרה מצוינת לתרופה מבוססת גנים בשל המבנה הסגור, הנגישות הטובה, הגודל הקטן והפריבילגיה החיסונית, ובכך מאפשרת אספקה מקומית של מינונים טיפוליים נמוכים והופכת את ההשתלות לפחות רגישות לדחייה. יתר על כן, העין מאפשרת ניטור לא פולשני, וניתן לבחון את הרשתית בטכניקות הדמיה שונות.
וקטורים נגיפיים הם, בגלל יעילות ההתמרה הגבוהה שלהם, הכלי העיקרי להעברת גנים טיפוליים לתאי מטרה. עם זאת, בהתאם לווקטור הנגיפי המשמש, תוארו תגובות שליליות שונות, כגון תגובות חיסוניות ודלקתיות26, השפעות מוטגניות ואונקוגניות27,28, או הפצה ברקמות אחרות 29. המגבלות המעשיות כוללות גודל אריזה מוגבל30 וכן קשיים ועלויות הכרוכים בייצור מגרשים ברמה קלינית31,32. חסרונות אלה קידמו את המשך הפיתוח של וקטורים לא ויראליים, מבוססי פלסמיד, המועברים באמצעות ליפו-/פוליפלקסים, אולטרסאונד או אלקטרופורציה. עם זאת, אינטגרציה גנומית של הטרנסגן לתוך הגנום המארח בדרך כלל אינה מקודמת עם וקטורים פלסמידים, וכתוצאה מכך ביטוי חולף.
טרנספוזונים הם מקטעי דנ”א טבעיים המשנים את מיקומם בתוך הגנום, מאפיין שאומץ לריפוי גנטי. בשל מנגנון אינטגרציה פעיל, מערכות וקטוריות מבוססות טרנספוזון מאפשרות ביטוי רציף וקבוע של הטרנסגן המוכנס. הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB), ששוחזר מטרנספוזון עתיק מסוג Tc1/mariner שנמצא בדגים33 ושופר עוד יותר על ידי אבולוציה מולקולרית וכתוצאה מכך הגרסה ההיפראקטיבית SB100X34, אפשרה טרנספוזיציה יעילה בתאים ראשוניים שונים ושימשה לתיקון פנוטיפי במודלים שונים של מחלות35. נכון לעכשיו, 13 ניסויים קליניים החלו באמצעות מערכת טרנספוזון SB . מערכת הטרנספוזון SB100X מורכבת משני מרכיבים: הטרנספוזון, המרכיב את הגן המעניין המוקף בחזרות הפוכות סופניות (TIRs), והטרנספוזה, המגייסת את הטרנספוזון. לאחר העברת דנ”א פלסמיד לתאים, הטרנספוזאז קושר את ה-TIRs ומזרז את הכריתה והאינטגרציה של הטרנספוזון בגנום של התא.
פיתחנו תוסף שאינו מבוסס על תאים נגיפיים לטיפול ב- AMD ניאו-וסקולרי. הגישה כוללת החדרה מבוססת אלקטרופורציה של הגן PEDF לתאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X 36,37,38. המידע הגנטי של הטרנספוזאז וה-PEDF מסופק על פלסמידים נפרדים, ובכך מאפשר התאמה של יחס הטרנספוזון האידיאלי SB100X-to-PEDF. האלקטרופורציה מתבצעת באמצעות מערכת טרנספקציה נימית מבוססת פיפטה המאופיינת בגודל מרווח מקסימלי בין האלקטרודות תוך מזעור שטח הפנים שלהן. הודגם כי המכשיר משיג שיעורי העברה מצוינים במגוון רחב של תאי יונקים 39,40,41. שטח הפנים של האלקטרודה הקטנה מספק שדה חשמלי אחיד ומפחית את תופעות הלוואי השונות של אלקטרוליזה42.
הפונקציונליות האנטי-אנגיוגנית של PEDF המופרשת על ידי תאי אפיתל פיגמנטיים שעברו טרנספקציה הודגמה בניסויים שונים במבחנה שניתחו את ההנבטה, הנדידה והאפופטוזיס של תאי אנדותל וורידי הטבור האנושיים43. בנוסף, השתלת תאים שעברו טרנספקציה של PEDF במודל ארנב של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית44 וכן מודל חולדות שלCNV 43,45,46 הראו ירידה של ניאו-וסקולריזציה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להחדרה יציבה של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת טרנספוזון SB100X באמצעות מערכת טרנספקציה נימרית. התאים שעברו טרנספקציה נשמרו בתרבית במשך 21 יום ולאחר מכן נותחו במונחים של ביטוי גנים של PEDF על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ובמונחים של הפרשת חלבון PEDF על ידי אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA, איור 1).
בפרויקט שלנו, אנו שואפים לייצור לא ויראלי של תאי RPE אנושיים ראשוניים מהונדסים גנטית, אשר מבטאים יתר על המידה ומפרישים ללא הרף גורם יעיל על מנת להשתמש בתאים המועתקים כטיפול ארוך טווח להקמה ותחזוקה של סביבה מגוננת. ביססנו את ההקדמה של הגן המקודד PEDF, חלבון רב-תפקודי המתבטא בכל מקום עם פונקציות…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי והדגמה, הסכם מענקים מס’ 305134. Zsuzsanna Izsvák מומן על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). המחברים רוצים להודות לאנה דוביאס ואנטג’ה שייפר (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על התמיכה הטכנית המצוינת, ולבנק הקרנית של אאכן (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על מתן עיני התורם האנושי.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |