Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

Summary

Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Abstract

Nuestra sociedad cada vez más envejecida conduce a una creciente incidencia de enfermedades neurodegenerativas. Hasta ahora, los mecanismos patológicos no se comprenden adecuadamente, lo que impide el establecimiento de tratamientos definidos. Las terapias génicas aditivas basadas en células para aumentar la expresión de un factor protector se consideran una opción prometedora para medicar enfermedades neurodegenerativas, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). Hemos desarrollado un método para la expresión estable del gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), que se caracteriza como una proteína neuroprotectora y antiangiogénica en el sistema nervioso, en el genoma de las células epiteliales pigmentarias humanas primarias (PE) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). Las células primarias de PE se aislaron de los ojos de donantes humanos y se mantuvieron en cultivo. Después de alcanzar la confluencia, se suspendieron 1 x 10⁴ células en 11 μL de tampón de resuspensión y se combinaron con 2 μL de una solución purificada que contenía 30 ng de plásmido transposasa SB (SB100X) hiperactivo y 470 ng de plásmido transposón PEDF. La modificación genética se realizó con un sistema de electroporación capilar utilizando los siguientes parámetros: dos pulsos con una tensión de 1.100 V y una anchura de 20 ms. Las células transfectadas se transfirieron a placas de cultivo que contenían medio suplementado con suero bovino fetal; Se agregaron antibióticos y antimicóticos con el primer intercambio medio. La transfección exitosa se demostró en experimentos realizados de forma independiente. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) mostró el aumento de la expresión del transgén PEDF. La secreción de PEDF se elevó significativamente y se mantuvo estable, según lo evaluado por inmunotransferencia y cuantificado por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La transferencia mediada por SB100X permitió una integración estable del gen PEDF en el genoma de las células PE y aseguró la secreción continua de PEDF, que es fundamental para el desarrollo de una terapia de adición de genes basada en células para tratar la DMAE u otras enfermedades degenerativas de la retina. Además, el análisis del perfil de integración del transposón PEDF en células PE humanas indicó una distribución genómica casi aleatoria.

Introduction

La edad avanzada se describe como el principal riesgo de enfermedades neurodegenerativas. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una enfermedad poligénica que conduce a una pérdida grave de la visión en pacientes mayores de 60 años, pertenece a las cuatro causas más comunes de ceguera y discapacidad visual¹ y se espera que aumente a 288 millones de personas en 2040². Las disfunciones del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una sola capa de células estrechamente empaquetadas ubicadas entre el coriocapilar y los fotorreceptores retinianos, contribuyen a la patogénesis de la DMAE. El EPR cumple múltiples tareas que son esenciales para una función normal de la retina³ y secreta una variedad de factores de crecimiento y factores esenciales para mantener la integridad estructural de la retina y el coriocapilar, apoyando así la supervivencia de los fotorreceptores y proporcionando una base para la circulación y el suministro de nutrientes.

En ojos sanos, el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) es responsable de equilibrar los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y protege a las neuronas contra la apoptosis, previene la proliferación de células endoteliales y estabiliza el endotelio capilar. El cambio de la relación VEGF-PEDF está relacionado con la neovascularización ocular, que se observó en modelos animales ^4,5, así como en muestras de pacientes con neovascularización coroidea (NVC) por DMAE y retinopatía diabética proliferativa 6,7,8,9,10 . La concentración mejorada de VEGF es el objetivo del tratamiento estándar actual. Los fármacos anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept y, más recientemente, brolucizumab mejoran la agudeza visual en aproximadamente un tercio de los pacientes con NVC o más bien estabilizan la visión en el 90% de los casos^11,12,13. Sin embargo, las inyecciones intravítreas frecuentes, a menudo mensuales, conllevan el riesgo de eventos adversos¹⁴, perjudican el cumplimiento del paciente y representan una carga económica significativa para los sistemas de salud¹⁵. Además, un cierto porcentaje de pacientes (2%-20%) no responden o sólo reaccionan mal a la terapia anti-VEGF^16,17,18,19. Estos concomitantes negativos requieren el desarrollo de tratamientos alternativos, por ejemplo, implantes intraoculares, enfoques terapéuticos celulares y / o genéticos.

La terapia génica ha evolucionado como un tratamiento prometedor para enfermedades hereditarias y no hereditarias y tiene la intención de restaurar secuencias de genes no funcionales o suprimir las que funcionan mal. Para las enfermedades poligénicas, donde la identificación y el reemplazo de los factores causales es casi imposible, las estrategias apuntan a la administración continua de un factor protector. En el caso de la DMAE, se han desarrollado diversas terapias aditivas, como la expresión estable de endostatina y angiostatina 20, el antagonista del VEGF soluble fms-like tirosina quinasa-1 (sFLT-1)21,22, el grupo de proteínas reguladoras del complemento de diferenciación 59 (CD59)²³ o PEDF ^24,25 . El ojo, y especialmente la retina, es un excelente objetivo para un medicamento basado en genes debido a la estructura cerrada, la buena accesibilidad, el tamaño pequeño y el privilegio inmunológico, lo que permite una administración localizada de dosis terapéuticas bajas y hace que los trasplantes sean menos susceptibles al rechazo. Además, el ojo permite una monitorización no invasiva, y la retina puede ser examinada por diferentes técnicas de imagen.

Los vectores virales son, debido a su alta eficiencia de transducción, el principal vehículo para administrar genes terapéuticos en las células diana. Sin embargo, dependiendo del vector viral utilizado, se han descrito diferentes reacciones adversas, como respuestas inmunes e inflamatorias²⁶, efectos mutagénicos y oncogénicos ^27,28 o diseminación en otros tejidos²⁹. Las limitaciones prácticas incluyen un tamaño de embalaje restringido³⁰, así como dificultades y costos asociados con la producción de lotes de grado clínico^31,32. Estos inconvenientes han promovido el desarrollo de vectores no virales basados en plásmidos que se transfieren a través de lipo / poliplexes, ultrasonido o electroporación. Sin embargo, la integración genómica del transgén en el genoma del huésped generalmente no se promueve con vectores plásmidos, lo que resulta en una expresión transitoria.

Los transposones son fragmentos de ADN naturales que cambian su posición dentro del genoma, una característica que se ha adoptado para la terapia génica. Debido a un mecanismo de integración activo, los sistemas vectoriales basados en transposones permiten una expresión continua y constante del transgén insertado. El transposón de la Bella Durmiente (SB), reconstituido a partir de un antiguo transposón de tipo Tc1/marinero encontrado en peces³³ y mejorado aún más por la evolución molecular que resultó en la variante hiperactiva SB100X³⁴, permitió la transposición eficiente en varias células primarias y fue utilizado para la corrección fenotípica en diferentes modelos de enfermedad³⁵. En la actualidad, se han iniciado 13 ensayos clínicos utilizando el sistema de transposones SB . El sistema de transposones SB100X consta de dos componentes: el transposón, que comprende el gen de interés flanqueado por repeticiones invertidas terminales (TIR), y la transposasa, que moviliza el transposón. Después de la entrega de ADN plásmido a las células, la transposasa se une a los TIR y cataliza la escisión e integración del transposón en el genoma de la célula.

Hemos desarrollado una terapia aditiva basada en células no virales para el tratamiento de la DMAE neovascular. El enfoque comprende la inserción basada en electroporación del gen PEDF en células epiteliales pigmentarias primarias (PE) por medio del sistema de transposón SB100X ^36,37,38. La información genética de la transposasa y el PEDF se proporciona en plásmidos separados, lo que permite el ajuste de la relación ideal de transposones SB100X a PEPF. La electroporación se realiza utilizando un sistema de transfección capilar basado en pipeta que se caracteriza por un tamaño de espacio maximizado entre los electrodos y minimiza su área de superficie. Se demostró que el dispositivo logra excelentes tasas de transfección en una amplia gama de células de mamíferos 39,40,41. La pequeña superficie del electrodo proporciona un campo eléctrico uniforme y reduce los diversos efectos secundarios de la electrólisis⁴².

La funcionalidad antiangiogénica del PEDF secretado por células epiteliales pigmentarias transfectadas fue demostrada en varios experimentos in vitro que analizaron la brotación, migración y apoptosis de células endoteliales de la vena umbilical humana⁴³. Además, el trasplante de células transfectadas con PEDF en un modelo de conejo de neovascularización corneal⁴⁴, así como un modelo de rata de CNV^43,45,46 mostraron disminución de la neovascularización.

Aquí, describimos un protocolo detallado para la inserción estable del gen PEDF en células RPE humanas primarias a través del sistema de transposón SB100X utilizando un sistema de transfección capilar. Las células transfectadas se mantuvieron en cultivo durante 21 días y posteriormente se analizaron en términos de expresión génica PEDF por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) y en términos de secreción de proteína PEDF por inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Figura 1).

Protocol

Los ojos de donantes humanos se obtuvieron del Banco de Córnea de Aquisgrán del Departamento de Oftalmología (Hospital Universitario RWTH Aachen) después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con los protocolos de la Declaración de Helsinki. Los procedimientos para la recolección y uso de muestras humanas han sido aprobados por el comité de ética institucional. 1. Aislamiento de células RPE humanas primarias Coloque ropa protectora estéril y guantes. Coloque una…

Representative Results

Cultivo y electroporación de células RPE humanas primariasHemos demostrado que la siembra de un número suficiente de células primarias del EPR de origen animal permite el cultivo y crecimiento a una monocapa integrada de células pigmentadas, de forma hexagonal36,37,48. Su capacidad para formar uniones estrechas, exhibir actividad fagocítica y expresar genes marcadores e…

Discussion

En nuestro proyecto, nuestro objetivo es la producción no viral de células RPE humanas primarias modificadas genéticamente que continuamente sobreexpresan y secretan un factor eficaz para utilizar las células transfectadas como terapéuticas a largo plazo para el establecimiento y mantenimiento de un entorno protector. Hemos establecido la introducción del gen que codifica PEDF, una proteína multifuncional expresada ubicuamente con funciones antiangiogénicas y neuroprotectoras. El protocolo descrito aquí se puede…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054