Vi har udviklet en protokol til at transficere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporation med genet, der koder for pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Vellykket transfektion blev påvist ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).
Vores stadig ældre samfund fører til en stigende forekomst af neurodegenerative sygdomme. Indtil videre er de patologiske mekanismer utilstrækkeligt forstået, hvilket hindrer etableringen af definerede behandlinger. Cellebaserede additive genterapier til øget ekspression af en beskyttende faktor betragtes som en lovende mulighed for at medicinere neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Vi har udviklet en metode til stabil ekspression af den genkodende pigmentepitelafledte faktor (PEDF), der er karakteriseret som et neurobeskyttende og anti-angiogent protein i nervesystemet, ind i genomet af primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler blev isoleret fra humane donorøjne og opretholdt i kultur. Efter at have nået sammenløbet blev 1 x 104 celler suspenderet i 11 μL resuspensionbuffer og kombineret med 2 μL af en oprenset opløsning indeholdende 30 ng hyperaktivt SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposonplasmid. Genetisk modifikation blev udført med et kapillærelektroporationssystem ved hjælp af følgende parametre: to impulser med en spænding på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transinficerede celler blev overført til dyrkningsplader indeholdende medium suppleret med føtalt bovint serum; antibiotika og antimykotika blev tilsat med den første mediumudveksling. Vellykket transfektion blev demonstreret i uafhængigt udførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) viste den øgede ekspression af PEDF-transgenet . PEDF-sekretionen var signifikant forhøjet og forblev stabil, som evalueret ved immunoblotting og kvantificeret ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). SB100X-medieret overførsel muliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet af PE-celler og sikrede kontinuerlig sekretion af PEDF, hvilket er kritisk for udviklingen af en cellebaseret genadditionsterapi til behandling af AMD eller andre retinale degenerative sygdomme. Desuden viste analyse af PEDF-transponens integrationsprofil i humane PE-celler en næsten tilfældig genomisk fordeling.
Fremskreden alder beskrives som den største risiko for neurodegenerative sygdomme. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en polygen sygdom, der fører til alvorligt synstab hos patienter over 60 år, hører til de fire mest almindelige årsager til blindhed og synshandicap1 og forventes at stige til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunktioner af retinal pigmentepitel (RPE), et enkelt lag af tæt pakkede celler placeret mellem choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrager til patogenesen af AMD. RPE udfører flere opgaver, der er afgørende for en normal retinal funktion3 og udskiller en række vækstfaktorer og faktorer, der er afgørende for at opretholde nethindens og choriocapillarisens strukturelle integritet, hvilket understøtter fotoreceptoroverlevelse og giver grundlag for cirkulation og tilførsel af næringsstoffer.
I sunde øjne er pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ansvarlig for at afbalancere virkningerne af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og beskytter neuroner mod apoptose, forhindrer endotelcelleproliferation og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskudt VEGF-til-PEDF-forhold er relateret til okulær neovaskularisering, som blev observeret i dyremodeller 4,5 såvel som i prøver af patienter med choroidal neovaskularisering (CNV) på grund af AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den øgede VEGF-koncentration er målet for den nuværende standardbehandling. Anti-VEGF-lægemidlerne bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos ca. en tredjedel af CNV-patienterne eller rettere stabiliserer synet i 90% af tilfældene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injektioner bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, forringer patienternes overholdelse og udgør en betydelig økonomisk byrde for sundhedssystemerne15. Desuden reagerer en vis procentdel af patienterne (2%-20%) ikke eller reagerer kun dårligt på anti-VEGF-behandlingen16,17,18,19. Disse negative samtidige nødvendiggør udvikling af alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilgange.
Genterapi har udviklet sig som lovende behandling af arvelige og ikke-arvelige sygdomme og har til hensigt at genoprette ikke-funktionelle gensekvenser eller undertrykke funktionsfejl. For polygene sygdomme, hvor identifikation og udskiftning af årsagsfaktorerne næppe er mulig, sigter strategier mod kontinuerlig levering af en beskyttende faktor. I tilfælde af AMD er der udviklet forskellige additive terapier, såsom den stabile ekspression af endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten opløselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, den komplementregulerende proteinklynge af differentiering 59 (CD59)23 eller PEDF 24,25 . Øjet, og især nethinden, er et glimrende mål for en genbaseret medicin på grund af den lukkede struktur, god tilgængelighed, lille størrelse og immunprivilegium, hvilket muliggør en lokaliseret levering af lave terapeutiske doser og gør transplantationer mindre modtagelige for afvisning. Desuden muliggør øjet ikke-invasiv overvågning, og nethinden kan undersøges ved forskellige billeddannelsesteknikker.
Virale vektorer er på grund af deres høje transduktionseffektivitet det vigtigste middel til at levere terapeutiske gener til målceller. Afhængigt af den anvendte virale vektor er der imidlertid beskrevet forskellige bivirkninger, såsom immun- og inflammatoriske reaktioner26, mutagene og onkogene virkninger 27,28 eller spredning i andre væv29. Praktiske begrænsninger omfatter en begrænset emballagestørrelse30 samt vanskeligheder og omkostninger forbundet med produktion af kliniske kvalitetspartier31,32. Disse ulemper har fremmet den videre udvikling af ikke-virale, plasmidbaserede vektorer, der overføres via lipo-/polyplexer, ultralyd eller elektroporation. Imidlertid fremmes genomisk integration af transgenet i værtsgenomet normalt ikke med plasmidvektorer, hvilket resulterer i et forbigående udtryk.
Transposoner er naturligt forekommende DNA-fragmenter, der ændrer deres position inden for genomet, en egenskab, der er blevet vedtaget til genterapi. På grund af en aktiv integrationsmekanisme giver transposonbaserede vektorsystemer mulighed for en kontinuerlig og konstant ekspression af det indsatte transgen. Tornerose (SB) transposon, rekonstitueret fra en gammel Tc1 / mariner-type transposon fundet i fisk33 og yderligere forbedret ved molekylær evolution, hvilket resulterede i den hyperaktive variant SB100X34, muliggjorde effektiv transponering i forskellige primære celler og blev brugt til fænotypisk korrektion i forskellige sygdomsmodeller35. På nuværende tidspunkt er der indledt 13 kliniske forsøg ved hjælp af SB-transposonsystemet. SB100X transposonsystemet består af to komponenter: transposonen, som omfatter genet af interesse flankeret af terminale inverterede gentagelser (TIR’er), og transposasen, som mobiliserer transposonen. Efter plasmid-DNA-levering til cellerne binder transposasen TIR’erne og katalyserer excisionen og integrationen af transposon i cellens genom.
Vi har udviklet en ikke-viral cellebaseret additiv terapi til behandling af neovaskulær AMD. Fremgangsmåden omfatter den elektroporationsbaserede indsættelse af PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af SB100X-transposonsystemet 36,37,38. Den genetiske information af transposase og PEDF tilvejebringes på separate plasmider, hvilket muliggør justering af det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforhold. Elektroporation udføres ved hjælp af et pipettebaseret kapillærtransfektionssystem, der er kendetegnet ved en maksimeret mellemrumsstørrelse mellem elektroderne, samtidig med at deres overfladeareal minimeres. Enheden viste sig at opnå fremragende transfekktionshastigheder i en bred vifte af pattedyrceller 39,40,41. Det lille elektrodeoverfladeareal giver et ensartet elektrisk felt og reducerer de forskellige bivirkninger af elektrolyse42.
Den anti-angiogene funktionalitet af PEDF udskilt af transinficerede pigmentepitelceller blev vist i forskellige in vitro-eksperimenter, der analyserede spiring, migration og apoptose af humane navlestrengsvenendotelceller43. Derudover viste transplantation af PEDF-transficerede celler i en kaninmodel af hornhinde neovaskularisering44 samt en rottemodel af CNV43,45,46 fald i neovaskularisering.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for stabil indsættelse af PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X-transposonsystemet ved hjælp af et kapillærtransfektionssystem. De transinficerede celler blev holdt i kultur i 21 dage og efterfølgende analyseret med hensyn til PEDF-genekspression ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og med hensyn til PEDF-proteinsekretion ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA, figur 1).
I vores projekt sigter vi mod ikke-viral produktion af genetisk modificerede primære humane RPE-celler, der kontinuerligt overudtrykker og udskiller en effektiv faktor for at bruge de transinficerede celler som langsigtet terapeutisk til etablering og vedligeholdelse af et beskyttende miljø. Vi har etableret introduktionen af genet, der koder for PEDF, et allestedsnærværende udtrykt multifunktionelt protein med anti-angiogene og neurobeskyttende funktioner. Den her beskrevne protokol kan bruges til stabilt og reprodu…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af EU’s syvende rammeprogram for forskning, teknologisk udvikling og demonstration, tilskudsaftale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák blev finansieret af Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Institut for Oftalmologi, Universitetshospitalet RWTH Aachen) for fremragende teknisk support og Aachen Cornea Bank (Institut for Oftalmologi, Universitetshospital RWTH Aachen) for at give de menneskelige donorøjne.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |