初白和棕色预生细胞与新生小鼠的隔离和分化
Summary
本报告描述了一个同时将原生棕色和白色预生细胞与新生小鼠隔离的协议。孤立的细胞可以在培养中生长，并诱导分化成完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法使培养中原脂肪细胞的遗传、分子和功能特征化。
Abstract
对脂肪细胞分化和功能背后的机制的理解大大受益于不朽的白色前体细胞系的使用。然而，这些培养的细胞系有局限性。它们不能完全捕获异质脂肪细胞种群的不同功能谱，这些细胞群现在已知存在于白色脂肪库中。为了提供一个更生理相关的模型来研究白脂肪组织的复杂性，已经开发和优化了一个协议，使原发性白细胞和棕色脂肪细胞祖先与新生小鼠同时隔离，它们在培养上迅速扩张，并在体外分化成成熟、功能齐全的脂肪细胞。将原细胞与新生儿而不是成年小鼠隔离开来的主要优点是脂肪库正在积极发育，因此是繁殖前细胞的丰富来源。使用此协议分离的主要预生细胞在达到汇合时迅速分化，并在 4-5 天内完全成熟，这是一个时间窗口，可准确反映新生小鼠发育的脂肪垫的外观。使用这种策略准备的主要培养物可以扩展和研究具有很高的可重复性，使其适合遗传和表型屏幕，并能够研究基因小鼠模型的细胞自主脂肪表型。此协议提供了一种简单、快速和廉价的方法，以研究体外脂肪组织的复杂性。
Introduction
肥胖症源于能量摄入和能量消耗之间的长期不平衡。随着肥胖的发展，白色脂肪细胞在细胞大小上经历了巨大的扩张，导致微环境缺氧，细胞死亡，炎症和胰岛素抵抗1。功能失调，肥大的脂肪细胞不能正确地储存多余的脂质，而积聚在其他组织中，它们抑制胰岛素作用2，3。改善脂肪细胞功能和恢复组织间正常脂质分区的制剂，预计对治疗以胰岛素抵抗（如2型糖尿病）为特征的肥胖相关疾病是有益的。使用不朽细胞系（如 3T3-L1、F442A 和 10T 1/2）在脂肪细胞中的表型屏幕已被证明有助于识别调节脂肪生成的遗传因素，并分离具有抗糖尿病特性的亲脂肪分子 4、5、6、7。然而，这些细胞系并不能完全反映脂肪库中细胞类型的异质性，包括具有独特特征的白色、棕色、米色和其他脂肪细胞亚型，所有这些都有助于系统性平衡8、9、10。此外，培养的细胞系通常显示对外部刺激的反应减弱。
相比之下，初级脂肪细胞培养更准确地概括了体内脂肪生成的复杂性，而原发性脂肪细胞则显示出强大的功能反应。主要的预生物细胞通常从成年小鼠11、12、13、14的脂肪库的频闪血管部分分离出来。然而，由于成年动物的脂肪库主要由完全成熟的脂肪细胞组成，其周转率非常缓慢，15、16、17，这种方法产生的预生细胞数量有限，增殖率低。因此，从新生小鼠身上分离出预生细胞比获得大量可在体外分化的快速生长细胞更可取。在这里，一个协议已经描述，灵感来自与卡恩等人的初级棕色脂肪细胞的初始工作，有效地隔离白色和棕色的预生细胞，可以在体外扩展和区分成功能齐全的初级脂肪细胞（图1A）。与成年小鼠相比，将原细胞与新生儿隔离开来的优点是脂肪库正在迅速生长，因此是积极增殖17预生细胞的丰富来源。使用此协议分离的细胞具有很高的扩散能力，能够快速扩展培养物。此外，新生幼崽的预生细胞比成年祖先具有更高的分化潜力，这降低了分化程度的变异性，从而增加了可重复性。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂肪组织对全身胰岛素敏感性和葡萄糖平衡20至关重要。肥胖相关脂肪细胞功能障碍与2型糖尿病的发病密切相关。因此，对脂肪组织的基本生物学和生理学的更深入的了解，可能有助于设计代谢紊乱的新疗法。作为对从脂肪库分离出来的成熟脂肪细胞的直接功能和转录分析的补充，培养的原发性脂肪细胞已被证明可以概括脂肪组织病?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢西班牙马德里国家生物技术中心的克里斯蒂娜·戈迪奥、斯克里普斯研究所的玛丽·甘特纳、巴尔的摩约翰霍普金斯大学的阿纳斯塔西娅·克拉利在卡恩等人的最初工作基础上帮助优化了这一协议。这项工作由NIH向E.S.提供DK114785和DK121196资助。
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
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