Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması
Summary
Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.
Abstract
Adiposit farklılaşması ve işlevinin altında kalan mekanizmaların anlaşılması, ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre çizgilerinin kullanımından büyük ölçüde yararlanmıştır. Ancak bu kültürlü hücre çizgilerinin sınırlamaları vardır. Şu anda beyaz yağ depolarında var olduğu bilinen heterojen adiposit popülasyonlarının çeşitli fonksiyonel spektrumlarını tam olarak yakalaymıyorlar. Beyaz yağ dokusunun karmaşıklığını incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili bir model sağlamak için, birincil beyaz ve kahverengi adiposit atalarının yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonunu, kültürdeki hızlı genişlemelerini ve in vitro’yu olgun, tamamen işlevsel adipositlere ayırmalarını sağlayacak bir protokol geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Birincil hücreleri yetişkin fareler yerine yenidoğandan izole etmenin birincil avantajı, yağ depolarının aktif olarak gelişmesi ve bu nedenle çoğalan preadipositlerin zengin bir kaynağı olmasıdır. Bu protokol kullanılarak izole edilen birincil preadipositler, birleşmeye ulaştıktan sonra hızla farklılaşır ve yenidoğan farelerde gelişmiş yağ pedlerinin görünümünü doğru bir şekilde yansıtan zamansal bir pencere olan 4-5 gün içinde tamamen olgunlaşır. Bu strateji kullanılarak hazırlanan birincil kültürler, yüksek tekrarlanabilirlik ile genişletilebilir ve incelenebilir, genetik ve fenotipik ekranlar için uygun hale getirilebilir ve genetik fare modellerinin hücre otonom adiposit fenotiplerinin incelenmesini sağlar. Bu protokol, yağ dokusu in vitro karmaşıklığını incelemek için basit, hızlı ve ucuz bir yaklaşım sunar.
Introduction
Obezite, enerji alımı ve enerji harcaması arasındaki kronik dengesizlikten kaynaklanır. Obezite geliştikçe, beyaz adipositler hücre boyutunda mikroçevrimde hipoksi, hücre ölümü, iltihaplanma ve insülin direnci ile sonuçlanan büyük bir genişlemeye uğrar1. İşlevsel olmayan, hipertrofiked adipositler, insülin eylemini sönümledikleri diğer dokularda biriken fazla lipitleri düzgün bir şekildedepolayamazlar 2,3. Adiposit fonksiyonunu iyileştiren ve dokular arasında normal lipid bölünmesini geri kazandıran ajanların tip 2 diyabet gibi insülin direnci ile karakterize obezite ile ilişkili durumların tedavisi için faydalı olacağı öngörülmektedir. 3T3-L1, F442A ve 10T 1/2 gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanan adipositlerdeki fenotipik ekranlar, adipogenez düzenleyen genetik faktörleri tanımlamak ve anti-diyabetik özelliklere sahip anti-adipojenik molekülleri izole etmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır4,5,6,7. Bununla birlikte, bu hücre çizgileri, hepsi sistemik homeostaz 8 ,9,10’akatkıda bulunan benzersiz özelliklere sahip beyaz, kahverengi, bej ve diğer adiposit alt tiplerini içeren yağ depolarında bulunan hücre tiplerinin heterojenliğini tam olarak yansıtmaz. Ayrıca, kültürlü hücre hatları genellikle dış uyaranlara karşı azalmış bir yanıt gösterir.
Buna karşılık, birincil adiposit kültürleri in vivo adipogenezin karmaşıklığını daha doğru bir şekilde rekapitüle eder ve birincil adipozitler sağlam işlevsel yanıtlar gösterir. Birincil preadipositler tipik olarak yetişkin farelerin yağ depolarının stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir11,12,13,14. Bununla birlikte, yetişkin hayvanların yağ depoları öncelikle çok yavaş bir ciro oranına sahip tamamen olgun adipositlerden oluştuğundan15,16,17, bu yaklaşım düşük çoğalma oranına sahip sınırlı miktarda preadiposit verir. Bu nedenle, preadipositlerin yenidoğan farelerden izole edilmesi, in vitro olarak ayırt edilebilen büyük miktarlarda hızla büyüyen hücreler elde etmek için tercih edilir. Burada, in vitro’yu tamamen işlevsel birincil adipositlere genişletilebilen ve ayırt edilebilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositleri verimli bir şekilde izole etmek için Kahn ve ark.18’in birincil kahverengi adipositleri ile yapılan ilk çalışmalardan esinlenen bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1A). Yetişkin farelerin aksine, birincil hücreleri yenidoğandan izole etmenin avantajı, yağ depolarının hızla büyümesi ve böylece aktif olarak çoğalan zengin bir preadiposit kaynağıolmasıdır 17. Bu protokol kullanılarak yalıtılmış hücreler, kültürlerin hızlı bir şekilde ölçeklendirilmesini sağlayan yüksek proliferatif kapasiteye sahiptir. Ek olarak, yenidoğan yavrularından gelen preadipositler, yetişkin atalardan daha yüksek farklılaşma potansiyeli gösterir, bu da farklılaşma derecesinde iyiden kuyuya değişkenliği azaltır ve böylece tekrarlanabilirliği arttırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yağ dokusu sistemik insülin duyarlılığı ve glikoz homeostaz için kritiktir20. Obeziteye bağlı adiposit disfonksiyonu tip 2 diyabetin başlangıcı ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Bu nedenle, yağ dokusunun temel biyolojisinin ve fizyolojisinin daha iyi anlaşılması metabolik bozukluklar için yeni tedavilerin tasarlanmasını sağlayabilir. Yağ depolarından izole olgun adipositlerin doğrudan fonksiyonel ve transkripsiyonel analizinin tamamlayıcısı olarak21<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Madrid, İspanya’daki Centro Nacional de Biotecnología’daki Cristina Godio’ya, Scripps Araştırma Enstitüsü’nden Mari Gantner’e, La Jolla’ya ve Baltimore Johns Hopkins Üniversitesi’nden Anastasia Kralli’ye, Kahn ve ark.18’inilk çalışmalarına dayanarak bu protokolün optimize edilmesine yardımcı oldukları için minnettarlar. Bu çalışma NIH tarafından FINANSE EdİlDİ DK114785 ve DK121196 E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
Referenzen
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
