Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos
Summary
Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.
Abstract
A compreensão dos mecanismos subjacentes à diferenciação e função adipócitos beneficiou-se muito do uso de linhas celulares pré-apócidas brancas imortalizadas. Essas linhas de células cultivadas, no entanto, têm limitações. Eles não capturam totalmente o espectro funcional diversificado das populações heterogênios que agora são conhecidas por existirem dentro de depósitos adiposos brancos. Para fornecer um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a complexidade do tecido adiposo branco, um protocolo foi desenvolvido e otimizado para permitir o isolamento simultâneo de progenitores adipócidos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos, sua rápida expansão na cultura e sua diferenciação in vitro em adipócitos maduros e totalmente funcionais. A principal vantagem de isolar células primárias de camundongos recém-nascidos, em vez de camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão se desenvolvendo ativamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação de pré-doenças. Os pré-doenças primários isolados usando este protocolo diferenciam-se rapidamente ao atingir a confluência e tornam-se totalmente maduros em 4-5 dias, uma janela temporal que reflete com precisão o aparecimento de almofadas de gordura desenvolvidas em camundongos recém-nascidos. As culturas primárias preparadas com essa estratégia podem ser expandidas e estudadas com alta reprodutibilidade, tornando-as adequadas para telas genéticas e fenotípicas e possibilitando o estudo dos fenótipos adipócitos autônomos de células de modelos genéticos de camundongos. Este protocolo oferece uma abordagem simples, rápida e barata para estudar a complexidade do tecido adiposo in vitro.
Introduction
A obesidade resulta de um desequilíbrio crônico entre o consumo de energia e o gasto energético. À medida que a obesidade se desenvolve, os adipócitos brancos sofrem uma expansão maciça no tamanho celular que resulta em hipóxia no microambiente, morte celular, inflamação e resistência à insulina1. Adipócitos disfuncionais e hipertróficos não conseguem armazenar adequadamente lipídios em excesso, que se acumulam em outros tecidos onde amortecem a ação da insulina2,3. Prevê-se que agentes que melhoram a função de adipócito e restaurem a partição lipídica normal entre os tecidos são considerados benéficos para o tratamento de condições associadas à obesidade caracterizadas pela resistência à insulina, como diabetes tipo 2. Telas fenotípicas em adipócitos usando linhas celulares imortalizadas, como 3T3-L1, F442A e 10T 1/2, têm se mostrado úteis para identificar fatores genéticos que regulam a adipogênese e isolar moléculas pró-adipogênicas com propriedades anti-diabéticas4,5,6,7. Essas linhas celulares, no entanto, não refletem totalmente a heterogeneidade dos tipos celulares presentes nos depósitos adiposos, que incluem subtipos brancos, marrons, bege e outros adipócitos com características únicas, todos os quais contribuem para a homeostase sistêmica8,9,10. Além disso, as linhas de células cultivadas frequentemente mostram uma resposta reduzida a estímulos externos.
Em contraste, culturas de adipócitos primários recapitulam com mais precisão a complexidade da adipogênese in vivo, e os adipócitos primários apresentam respostas funcionais robustas. Os pré-iícios primários são tipicamente isolados da fração vascular estromica dos depósitos adiposos de camundongos adultos11,12,13,14. No entanto, como os depósitos adiposos de animais adultos consistem principalmente de adipócitos totalmente maduros que têm uma taxa de rotatividade muito lenta15,16,17, essa abordagem produz uma quantidade limitada de pré-doenças com baixa taxa de proliferação. Portanto, o isolamento de preadipócitos de camundongos recém-nascidos é preferível obter grandes quantidades de células de rápido crescimento que podem ser diferenciadas in vitro. Aqui, foi descrito um protocolo, inspirado no trabalho inicial com adipócitos marrons primários de Kahn et al.18 para isolar eficientemente preadipócitos brancos e marrons que podem ser expandidos e diferenciados in vitro em adipócitos primários totalmente funcionais(Figura 1A). A vantagem de isolar células primárias de recém-nascidos, ao contrário dos camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão crescendo rapidamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação ativa de pré-doenças17. Células isoladas usando este protocolo têm alta capacidade de proliferação, permitindo uma rápida ampliação das culturas. Além disso, os pré-nascidos de filhotes apresentam maior potencial de diferenciação do que os progenitores adultos, o que reduz a variabilidade bem-para-bem na extensão da diferenciação e, portanto, aumenta a reprodutibilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tecido adiposo é fundamental para a sensibilidade sistêmica da insulina e a homeostase de glicose20. A disfunção adipócito ligada à obesidade está fortemente associada ao aparecimento do diabetes tipo 2. Portanto, uma maior compreensão da biologia básica e fisiologia do tecido adiposo pode permitir a concepção de novos tratamentos para distúrbios metabólicos. Como complemento à análise funcional e transcricional direta de adipócitos maduros isolados dos depósitos de gordura<sup …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Cristina Godio no Centro Nacional de Biotecnología em Madrid, Espanha, Mari Gantner no The Scripps Research Institute, La Jolla, e Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins, baltimore, por assistência otimizando este protocolo com base no trabalho inicial de Kahn et al.18. Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH DK114785 e DK121196 para E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
Referenzen
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
