Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli
Summary
Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.
Abstract
Geacetyleerde histoneiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt in Escherichia coli die codeert voor een mutant, Nε-acetyl-lysine (AcK)-specifieke Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) en zijn cognate tRNA (tRNAPyl) om gereconstitueerde mononucleosomen te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. MmAcKRS1 en tRNAPyl leveren AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om AcK op H3 lysine sites op te nemen. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) kan ook gemakkelijk worden geëvolueerd om andere niet-canonische aminozuren (ncAAs) op te nemen voor sitespecifieke eiwitmodificatie of functionalisatie. Hier beschrijven we een methode om AcK met behulp van het MmAcKRS1-systeem in histon H3 op te nemen en acetylated H3-eiwitten te integreren in gereconstitueerde mononucleosomen. Geacetyleerde gereconstitueerde mononucleosomen kunnen worden gebruikt bij biochemische en bindende assays, structuurbepaling en meer. Het verkrijgen van gemodificeerde mononucleosomen is cruciaal voor het ontwerpen van experimenten met betrekking tot het ontdekken van nieuwe interacties en het begrijpen van epigenetica.
Introduction
We hebben PylRS en tRNAPyl gebruikt om gereconstitueerde mononucleosomen te synthetiseren en te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. PylRS is van onschatbare waarde gebleken als een genetische code-uitbreidingstool om eiwitten te produceren met post translationele modificaties (PTM’s) en is genetisch geëvolueerd om ongeveer 200 verschillende NCA’s op te nemen. PylRS neemt op bij een amber stop codon, waardoor concurrentie van andere aminozuren tijdens de vertaling wordt verwijderd. PylRS werd voor het eerst ontdekt in methanogene archaea en is sindsdien gebruikt in de chemische biologie om nieuwe reactieve chemische groepen op te nemen in eiwitten1,2.
MmAcKRS1 is geëvolueerd uit Methanosarcina mazei PylRS en wordt vaak gebruikt in ons laboratorium voor de synthese van geacetyleerde eiwitten3,4,5,6. MmAcKRS1 levert AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is eerder gebruikt om AcK op K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 en K79 histon H3 lysine sites te bestuderen om de activiteit van Sirtuin 1, 2, 6 en 7 op geacetyleerde mononucleosomen4,5,6te bestuderen . Hier beschrijven we deze methode om geacetyleerde histonen uit te drukken en geacetyleerde nucleosomen te reconstitueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is essentieel om dit protocol in elk detail te volgen tijdens een experiment. Nucleosomen zijn niet erg stabiel en er is veel vallen en opstaan gegaan bij het bepalen van dit protocol. Het is belangrijk om neerslag bij elke stap (of wanneer waargenomen) te verwijderen, omdat deeltjes gemakkelijk de assemblageprocessen kunnen verstoren. Hou zijn toonmonsters altijd op ijs. Als nucleosomen te lang bij 4 °C worden bewaard, kunnen ze spontaan uit elkaar vallen. Zorg ervoor dat u monsters van Native PAGE controleert als …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Wesley Wang bedanken voor het leggen van de basis voor dit protocol en zijn waardevolle mentorschap. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institutes of Health (Grants R01GM127575 en R01GM121584) en Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
Referenzen
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2′-5′-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2′,5′)pA(3′,5′)p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
