Acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez Escherichia coli
Summary
Nous présentons ici une méthode pour exprimer les protéines histones acétylées en utilisant l’expansion du code génétique et assembler des nucléosomes reconstitués in vitro.
Abstract
Les protéines histones acétylées peuvent être facilement exprimées dans Escherichia coli codant pour un mutant, Nε-acétyl-lysine (AcK)-methanosarcina mazi pyrrolysine ARNt-synthétase (MmAcKRS1) et son ARNt apparenté (ARNtPyl)pour assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. MmAcKRS1 et tRNAPyl délivrent AcK à un emplacement ambré de mutation dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été largement utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine H3. La pyrrolysyl-ARNt synthétase (PylRS) peut également être facilement évoluée pour incorporer d’autres acides aminés non canoniques (NCAAs) pour la modification ou la fonctionnalisation des protéines spécifiques au site. Ici, nous détaillons une méthode pour incorporer AcK en utilisant le système MmAcKRS1 dans l’histone H3 et intégrer les protéines H3 acétylées dans les mononucléosomes reconstitués. Les mononucléosomes reconstitués acétylés peuvent être utilisés dans les tests biochimiques et de liaison, la détermination de la structure, etc. L’obtention de mononucléosomes modifiés est cruciale pour concevoir des expériences liées à la découverte de nouvelles interactions et à la compréhension de l’épigénétique.
Introduction
Nous avons utilisé PylRS et tRNAPyl pour synthétiser et assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. PylRS s’est avéré inestimable en tant qu’outil d’expansion du code génétique pour produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles (PTM) et a été génétiquement évolué pour incorporer environ 200 NCA différents. PylRS incorpore au codon ambré, éliminant la concurrence d’autres acides aminés pendant la traduction. PylRS a été découvert pour la première fois dans les archées méthanogènes, et a depuis été utilisé en biologie chimique pour incorporer de nouveaux groupes chimiques réactifs dans les protéines1,2.
MmAcKRS1 a été développé à partir de Methanosarcina mazei PylRS et fréquemment utilisé dans notre laboratoire pour la synthèse de protéines acétylées3,4,5,6. MmAcKRS1 délivre ack à un site de mutation ambrée dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été précédemment utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 et K79 de l’histone H3 afin d’étudier l’activité de la sirtuine 1, 2, 6 et 7 sur les mononucléosomes acétylés4,5,6. Ici, nous détaillons cette méthode pour exprimer les histones acétylées et reconstituer les nucléosomes acétylés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel de suivre ce protocole dans les moindres détails lors d’une expérience. Les nucléosomes ne sont pas très stables et beaucoup d’essais et d’erreurs ont été consacrés à la détermination de ce protocole. Il est essentiel d’éliminer les précipités à chaque étape (ou chaque fois qu’elles sont observées), car les particules peuvent facilement interférer avec les processus d’assemblage. Gardez toujours les échantillons d’histones sur la glace. Si les nucléosomes sont stockés à …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Wesley Wang d’avoir jeté les bases de ce protocole et de son précieux mentorat. Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (subventions R01GM127575 et R01GM121584) et la Fondation Welch (subvention A-1715).
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
Referenzen
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