Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode, um acetylierte Histonproteine mittels genetischer Codeerweiterung auszudrücken und rekonstituierte Nukleosomen in vitro zusammenzusetzen.

Zusammenfassung

Acetylatierte Histonproteine können leicht in Escherichia coli exprimiert werden, die eine Mutante, N^ε-Acetyl-Lysin (AcK)-spezifische Methanosarcina mazi pyrrolysinttRNA-Synthetase (MmAcKRS1) und ihre kognade tRNA (tRNA^Pyl) zur Zusammenstellung rekonstituierter Mononukleosomen mit MmAcKRS1 und tRNA^Pyl liefern AcK an einer Bernsteinmutationsstelle in der mRNA der Wahl während der Translation in Escherichia coli. Diese Technik wurde ausgiebig verwendet, um AcK an H3-Lysin-Standorten zu integrieren. Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS) kann auch leicht entwickelt werden, um andere nichtkanonische Aminosäuren (ncAAs) für die standortspezifische Proteinmodifikation oder -funktionalisierung zu integrieren. Hier beschreiben wir eine Methode, AcK mit dem MmAcKRS1-System in Histon H3 zu integrieren und acetylierte H3-Proteine in rekonstituierte Mononukleosomen zu integrieren. Acetylierte rekonstituierte Mononukleosomen können in biochemischen und verbindlichen Assays, Strukturbestimmung und mehr verwendet werden. Die Beschaffung modifizierter Mononukleosomen ist entscheidend für die Entwicklung von Experimenten im Zusammenhang mit der Entdeckung neuer Wechselwirkungen und dem Verständnis der Epigenetik.

Einleitung

Wir haben PylRS und tRNA^Pyl verwendet, um rekonstituierte Mononukleosomen mit standortspezifischen acetylierten Histonen zu synthetisieren und zusammenzusetzen. PylRS hat sich als genetisches Codeerweiterungstool zur Herstellung von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) als unschätzbar erwiesen und wurde genetisch weiterentwickelt, um etwa 200 verschiedene ncAAs zu integrieren. PylRS enthält an einem Bernstein-Stop-Codon, wodurch die Konkurrenz von anderen Aminosäuren während der Übersetzung entfernt wird. PylRS wurde zuerst in methanogenen Archaeen entdeckt und wird seitdem in der chemischen Biologie verwendet, um neuartige reaktive chemi....

Protokoll

1. Plasmidkonstruktion

1. Beginnen Sie mit der Entscheidung, welches Histonprotein acetyliert wird und an welcher Lysin-Stelle. Mutieren Sie die Seite zum Bernstein-Stop-Codon (TAG) mit Website gerichtet Etagenese.
   HINWEIS: Es gibt vier zuvor entwickelte Plasmide, die für die Expression von Histonproteinen verwendet werden. Alle vier Histonproteine wurden mit einem N-terminalen Histidin-Tag in den pETDuet-1-Vektor geklont. Histone H4 enthält auch ein SUMO-Tag, den Ursprung der Replikation colE1 mit einer Kopiernummer von etwa 40, Ampicillin-resistent, und ein T7-Promoter.
   1. Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine TAG-Mutation an ....

Ergebnisse

Dimere, Tetramere und Okmamer können mit einem 12% SDS PAGE Gel bewertet werden (Abbildung 1 und Abbildung 2). Hier können Sie sehen, dass einige der acetylierten Tetramere eine geringere Ausbeute haben als andere (Abbildung 1). In der Tat, je näher an der Kernregion, desto niedriger der Ertrag beobachtet. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Acetylierung zurückzuführen, die die Zusammenstellung des.......

Diskussion

Es ist wichtig, dieses Protokoll während eines Experiments bis ins kleinste Detail zu befolgen. Nukleosomen sind nicht sehr stabil und viel Versuch und Irrtum ist in die Bestimmung dieses Protokolls gegangen. Es ist der Schlüssel, um Ausscheidungen bei jedem Schritt (oder wann immer beobachtet) zu entfernen, da Partikel leicht die Montageprozesse stören können. Halten Sie seine Tonproben immer auf Eis. Werden Nukleosomen zu lange bei 4 °C gelagert, können sie sich spontan zerlegen. Achten Sie darauf, alle Proben von Nati.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M TE Puffer	NA		NA 0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
1 M TE Puffer	NA		NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x TE Puffer	NA
2 M TE Puffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM TE Puffer	NA		NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
6 M GuHCl			6M Guanidiniumchlorid, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
Acetyllysin
Column Wash Puffer	NA	NA	6 M Harnstoff, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM Imidazol pH 7,8
Elutionspuffer	NA	NA
Fisherbrand Chemikalientransferpumpe mit variablem Durchfluss	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV-Protease
Histon-Lysepuffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5 % Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0
Ni-NTA-Harz			6 M Harnstoff, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM Imidazol, pH 7,8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA		60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Lagerpuffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% Glycerin, pH 7,8
Thermocycler

NA