여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.
아세틸화 히스톤 단백질은 돌연변이, N ε-아세틸-리신(AcK)-특이적 메타노사르시나 마지 피롤리신 tRNA-synthetase(MmAcKRS1) 및 그 코그네이트 tRNA(tRNAPyl)를결합하여 재구성한 단핵형 특이적 군수로 재구성할 수 있는 에셀리치아 대장균에서 용이하게 발현될 수 있다. MmAcKRS1 및 tRNAPyl은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 황색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 H3 lysine 사이트에 AcK를 통합하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)는 또한 사이트 특정 단백질 수정 또는 기능화를 위한 다른 비카노마이컬 아미노산(ncAA)을 통합하도록 쉽게 진화될 수 있다. 여기서 우리는 MmAcKRS1 시스템을 사용하여 AcK를 히스톤 H3에 통합하고 아세틸화 된 H3 단백질을 재구성 된 단핵구로 통합하는 방법을 자세히 설명합니다. 아세틸화 재구성 된 단핵구는 생화학 적 및 결합 적 반응, 구조 결정 등에 사용될 수 있습니다. 수정된 단핵구를 얻는 것은 새로운 상호 작용을 발견하고 후성 유전학을 이해하는 관련있는 실험을 디자인하기 위해 중요합니다.
우리는 PylRS와 tRNAPyl을 사용하여 사이트 특정 아세틸화 히스톤으로 재구성된 단핵구를 합성하고 조립했습니다. PylRS는 포스트 번역 변형 (PTM)을 가진 단백질을 생성하는 유전 코드 확장 도구로 귀중한 입증하고 약 200 다른 ncAA를 통합하기 위해 유전적으로 진화되었습니다. PylRS는 호박색 정지 코돈에 통합되어 번역 중에 다른 아미노산에서 경쟁을 제거합니다. PylRS는 메탄원성 고고학에서 처음 발견되었으며, 이후 화학 생물학에서 새로운 반응성 화학 그룹을 단백질1,2에통합하는 데 활용되었습니다.
MmAcKRS1은 메타노사르키나 미제이 PylRS로부터 진화하고 아세틸화된 단백질3,4,5,6의합성을 위해 실험실에서 자주 사용되었다. MmAcKRS1은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 호박색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 이전에 K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, K79 히스톤 H3 리신 부위에 AcK를 통합하여 1, 2, 6, 7의 아세트 모노뉴클레오솜4,5,6의AcK를 통합하는 데 사용되었습니다. 여기서 우리는 아세틸화 된 히스톤을 발현하고 아세틸화 뉴클레오좀을 재구성하는이 방법을 자세히 설명합니다.
실험 중에 이 프로토콜을 모든 세부 사항으로 따르는 것이 필수적입니다. 뉴클레오좀은 매우 안정적이지 않으며 많은 시행착오가 이 프로토콜을 결정하는 데 들어갔습니다. 미립자가 조립 공정을 쉽게 방해할 수 있기 때문에 모든 단계(또는 관찰 될 때마다)에서 침전을 제거하는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 히스톤 샘플을 유지합니다. 뉴클레오좀이 너무 오래 4°C로 저장되면 자발적으로 분해?…
The authors have nothing to disclose.
웨슬리 왕 박사에게 이 프로토콜과 그의 소중한 멘토링에 대한 기초를 마련해 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (보조금 R01GM127575 및 R01GM121584) 및 웰치 재단 (그랜트 A-1715).
0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
100x TE Buffer | NA | NA | |
2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
Acetyllysine | |||
Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
Elution Buffer | NA | NA | |
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
His-TEV protease | |||
Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
petDUET-His-TEV-H2A | |||
petDUET-His-TEV-H2B | |||
petDUET-His-TEV-H3 | |||
pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
Thermocycler |