استقر الطولي في فيفو الخلوية المستوى التصور من البنكرياس في نموذج مورين مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس
Summary
في الجسم الحي عالية الدقة التصوير البنكرياس تم تسهيل مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس.
Abstract
مباشرة في الجسم الحي الخلوي القرار التصوير البنكرياس في نموذج صغير يعيش كان تحديا من الناحية الفنية. وقد مكنت دراسة حديثة للتصوير داخل الجسم، مع نافذة تصوير البطن، من تصور الديناميكيات الخلوية في أعضاء البطن في الجسم الحي. ومع ذلك ، بسبب البنية الناعمة الشبيهة بالصفائح لبنكرياس الماوس التي يمكن أن تتأثر بسهولة بالحركة الفسيولوجية (على سبيل المثال ، التثابر والتنفس) ، كان من الصعب إجراء تصوير طولي مستقر في التصوير الحي على مدى عدة أسابيع على المستوى الخلوي لتحديد الجزر أو الخلايا السرطانية في البنكرياس الماوس وتتبعها وتحديدها كميا. هنا، ونحن نصف طريقة لزرع قاعدة دعم جديدة، نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس المتكاملة، التي يمكن أن تفصل مكانيا البنكرياس من الأمعاء للتصوير الطولي الفاصل الزمني داخل الجسم من البنية المجهرية البنكرياس. التصوير الطولي في الجسم الحي مع نافذة التصوير يمكن التصور مستقرة، مما يسمح لتتبع الجزر على مدى فترة 3 أسابيع وعالية الدقة التصوير ثلاثي الأبعاد من البنية المجهرية، كما يتضح هنا في نموذج سرطان البنكرياس العظام. مع طريقتنا، يمكن لمزيد من دراسات التصوير داخل الأمعاء توضيح الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض التي تنطوي على البنكرياس على المستوى الخلوي.
Introduction
البنكرياس هو عضو في البطن مع وظيفة الغدد الصماء في الجهاز الهضمي ووظيفة الغدد الصماء من إفراز الهرمونات في مجرى الدم. يمكن أن يكشف التصوير الخلوي عالي الدقة للبنكرياس عن الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض التي تشمل البنكرياس ، بما في ذلك التهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس ومرض السكري1. تتوفر أدوات التصوير التشخيصي التقليدية مثل التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بدقة مغناطيسية والتصوير فائق السونوغرافيا على نطاق واسع في المجال السريري1و2. ومع ذلك، تقتصر طرائق التصوير هذه على تصور التغيرات الهيكلية أو التشريحية فقط، في حين لا يمكن تحديد التعديلات على المستوى الخلوي أو الجزيئي. وبالنظر إلى أن التغيرات الجزيئية في مرض السكري أو سرطان البنكرياس في البشر يمكن أن تبدأ أكثر من 10 سنوات قبل التشخيص3،4، والكشف عن أمراض البنكرياس من انتقالها الجزيئي خلال الفترة الكامنة لديه القدرة على توفير التشخيص المبكر والتدخل في الوقت المناسب. وهكذا، فإن التصوير الذي سيتغلب على قيود الدقة ويوفر رؤى قيمة في الوظيفة سيكسب الانتباه بشكل ملحوظ من خلال توفير التشخيص المبكر لسرطان البنكرياس أو تحديد متقدم لتغيير الجزر أثناء تطور مرض السكري5.
وعلى وجه الخصوص مع الجزر، تم اقتراح التصوير النووي، والتصوير الإضاءة الحيوية، والتصوير المقطعي التماسك البصري وتقنيات التصوير الجزيرة غير الغازية6. ومع ذلك ، فإن دقة هذه الأساليب منخفضة إلى حد كبير ، مع قيم نموذجية تتراوح بين عدة عشرات إلى مئات من ميكرومتر ، مما يوفر قدرة محدودة على اكتشاف التغيرات على المستوى الخلوي في الجزر. من ناحية أخرى، أجريت دراسات سابقة عالية الدقة من الجزر تحت الجسم الحي السابق7،8 (على سبيل المثال ، تشريح أو هضم البنكرياس) ، غيرالفسيولوجية 9 (على سبيل المثال ، التشظي الخارجي للبنكرياس) ، والحالات غير النظيرية10،11،12 (على سبيل المثال ، الزرع تحت كبسولة الكلى ، داخل الكبد ، وفي الغرفة الأمامية للعين) ، مما يحد من تفسيرها وآثارها السريرية. إذا كان في الجسم الحي, فسيولوجيا, ويمكن إنشاء نموذج تقويم العظام من التصوير عالية الدقة, وسوف يكون منصة حاسمة للتحقيق في الجزر البنكرياس.
وقد تلقى التصوير داخلفيتال، الذي يكشف عن الفيزيولوجيا المرضية على مستوى الدقة المجهرية في حي، مؤخرا اهتماما كبيرا13. من طرق التصوير في الجسم الحي ، وقد سمح تطوير نافذة تصوير البطن14، الذي يزرع نافذة في بطن الفأر ، واكتشاف نتائج جديدة (أي مرحلة ما قبل micrometastasis من الانبثاث الكبد المبكر15 وآلية صيانة الخلايا الجذعية في ظهارة الأمعاء16). على الرغم من أن نافذة التصوير البطني توفر نتائج قيمة، إلا أن تطبيقات هذه النافذة للبنكرياس وأبحاث التصوير داخل الأمعاء الناتجة عن ذلك على أساس الأمراض التي تنطوي على البنكرياس، لم يتم التحقيق فيها على نطاق واسع.
على عكس خصائص الأعضاء الصلبة المحددة جيدا للبنكرياس البشري ، فإن البنكرياس للفأر هو هيكل يشبه الأنسجة الرخوة الموزعة بشكل منتشر17. لذلك ، فإنه يتأثر باستمرار بالحركات الفسيولوجية بما في ذلك التثاق والتنفس. أظهرت دراسة سابقة على تطبيق نافذة تصوير البطن للبنكرياس أن التجول حدث بسبب الحركة القطع الأثرية الناجمة عن حركات الأمعاء18. ولوحظ عدم وضوح شديد في متوسط الصورة الناتجة، مما أعاق تصور وتحديد الهياكل الصغيرة.
هنا، ونحن نصف استخدام قاعدة دعم جديدة متكاملة نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس جنبا إلى جنب مع المجهر داخل الجسم19،20 للتحقيق في أحداث المستوى الخلوي الطولي في الأمراض التي تنطوي على البنكرياس. بالإضافة إلى وصف مفصل للمنهجية في الدراسة السابقة18، سيتم تناول التطبيق الموسع لنافذة تصوير البنكرياس لمختلف الأمراض التي تنطوي على البنكرياس في هذه الورقة. وفي هذا البروتوكول، استخدم نظام مجهري كونفوكوكال مصمم خصيصا لمعدل الفيديو كنظام مجهري داخل الفيتية. واستخدمت أربع وحدات ليزر (أطوال موجية في 405 و488 و561 و640 نانومتر) كمصدر للإثارة، وتم الكشف عن أربع قنوات لإشارات الانبعاثات بواسطة أنابيب التمائم الضوئي (PMT) من خلال مرشحات ممر النطاق (BPF1: FF01-442/46؛ BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). تألف المسح بالليزر من مرآة مضلعة دوارة (محور X) ومرآة مسح مقياس ال galvanometer (محور ص) التي مكنت المسح الضوئي لمعدل الفيديو (30 إطارا في الثانية). وقد وصفت معلومات مفصلة عن المجهر داخلفيتال في الدراسات السابقة10،18،19،20،21،22،23.
في دراستنا السابقة جزيرة18، ونحن بنجاح وثبات صورت الجزر في الفئران الحية باستخدام نموذج الماوس المعدلة وراثيا (MIP – GFP)24 التي تم وضع علامات الجزر مع GFP. مكنت الطريقة التصور عالي الدقة للتغييرات في الجزر على مدى فترة أسبوع واحد. كما سهل تصوير نفس الجزر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ، مما يشير إلى جدوى الدراسات طويلة الأجل لقنيائل البنكرياس للتتبع الوظيفي أو الرصد أثناء مرض السكري18. وعلاوة على ذلك, وضعنا نموذج سرطان البنكرياس العظام التي الفلورسنت خلايا سرطان البنكرياس (PANC-1 NucLight الأحمر)25 زرعت مباشرة في البنكرياس من الماوس. مع تطبيق نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس, ويمكن استخدام هذا النموذج كمنصة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية الخلوية والجزيئية في البيئة الدقيقة الورم من سرطان البنكرياس والرصد العلاجي للمرشحين المخدرات الرواية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا يتكون من التصوير داخل الجسم البنكرياس باستخدام قاعدة دعم جديدة متكاملة نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس تعديل من نافذة التصوير البطني. من بين البروتوكولات المذكورة أعلاه ، فإن الخطوة الحرجة الأولى هي زرع نافذة تصوير البنكرياس داخل الجسم في الماوس. لتطبيق الغراء…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنحة رقم 14-2020-002 من صندوق أبحاث SNUBH ومنحة المؤسسة الوطنية لبحوث كوريا (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (NRF-2020R1F1A1058381، NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
Referenzen
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Krebsforschung. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
