Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster
Summary
In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.
Abstract
Directe in vivo cellulaire resolutie beeldvorming van de alvleesklier in een levend klein diermodel is technisch uitdagend geweest. Een recente intravital imaging studie, met een abdominale imaging window, maakte visualisatie van de cellulaire dynamiek in buikorganen in vivomogelijk . Vanwege de zachte bladachtige architectuur van de muisalvleesklier die gemakkelijk kan worden beïnvloed door fysiologische beweging (bijv. peristaltiek en ademhaling), was het echter moeilijk om gestabiliseerde longitudinale in vivo beeldvorming gedurende enkele weken op cellulair niveau uit te voeren om eilandjes of kankercellen in de muisalvleesklier te identificeren, te volgen en te kwantificeren. Hierin beschrijven we een methode voor het implanteren van een nieuwe ondersteunende basis, een geïntegreerd pancreas intravital imaging venster, dat de alvleesklier ruimtelijk van de darm kan scheiden voor longitudinale time-lapse intravital imaging van de alvleesklier microstructuur. Longitudinale in vivo beeldvorming met het beeldvormingsvenster maakt stabiele visualisatie mogelijk, waardoor eilandjes over een periode van 3 weken kunnen worden gevolgd en driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de microstructuur, zoals hier blijkt uit een orthotopisch pancreaskankermodel. Met onze methode kunnen verdere intravital imaging studies de pathofysiologie van verschillende ziekten waarbij de alvleesklier op cellulair niveau betrokken is, verduidelijken.
Introduction
De alvleesklier is een buikorgaan met een exocriene functie in het spijsverteringskanaal en een endocriene functie van het afscheiden van hormonen in de bloedbaan. Hoge resolutie cellulaire beeldvorming van de alvleesklier kan de pathofysiologie onthullen van verschillende ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is, waaronder pancreatitis, alvleesklierkanker en diabetes mellitus1. Conventionele diagnostische beeldvormingstools zoals computertomografie, magnetische resolutiebeeldvorming en ultrasonografie zijn op grote schaal beschikbaar in het klinische veld1,2. Deze beeldvormingsmodaliteiten zijn echter beperkt tot het visualiseren van alleen structurele of anatomische veranderingen, terwijl veranderingen op cellulair of moleculair niveau niet kunnen worden bepaald. Gezien het feit dat moleculaire veranderingen in diabetes mellitus of alvleesklierkanker bij mensen meer dan 10 jaar voorafgaand aan de diagnose3,4kunnen initiëren, heeft de detectie van pancreasziekten uit hun moleculaire overgang tijdens de latente periode het potentieel om een vroege diagnose en een tijdige interventie te bieden. Beeldvorming die de beperkingen van de resolutie zal overwinnen en waardevolle inzichten in de functie zal bieden, zal dus opmerkelijk veel aandacht krijgen door een vroege diagnose van alvleesklierkanker of geavanceerde identificatie van de verandering van de eilandjes tijdens de progressie van diabetes mellitus5.
Met name met de eilandjes zijn nucleaire beeldvorming, bioluminescentiebeeldvorming en optische coherentietomografie voorgesteld als niet-invasieve eilandjesbeeldvormingstechnieken6. De resolutie van deze methoden is echter aanzienlijk laag, met typische waarden variërend van enkele tientallen tot honderden micrometers, die een beperkte mogelijkheid bieden om veranderingen op cellulair niveau in de eilandjes te detecteren. Aan de andere kant werden eerdere studies met hoge resolutie van eilandjes uitgevoerd onder ex vivo7,8 (bijv. snijden of vertering van de alvleesklier), niet-fysiologische9 (bijv. exteriorisatie van de alvleesklier) en heterotone aandoeningen10,11,12 (bijv. implantatie onder de niercapsule, in de lever en in de voorste kamer van het oog), wat hun interpretatie en klinische implicaties beperkt. Als in vivo,fysiologisch en orthotopisch model van hoge resolutie beeldvorming kan worden vastgesteld, zal het een cruciaal platform zijn voor het onderzoek van pancreas eilandjes.
Intravital imaging, die de pathofysiologie op microscopisch resolutieniveau bij een levend dier onthult, heeft onlangs veel aandacht gekregen13. Van de in vivo beeldvormingsmethoden heeft de ontwikkeling van een abdominale beeldvormingsvenster14, dat een venster in de buik van een muis implanteert, de ontdekking van nieuwe bevindingen mogelijk maken (d.w.z. een premicrometastasestadium van vroege levermetastase15 en mechanisme van stamcelonderhoud in het darmepitheel16). Hoewel het abdominale beeldvormingsvenster waardevolle resultaten oplevert, zijn de toepassingen van dit venster voor de alvleesklier en het resulterende intravital imaging-onderzoek op basis van ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is, niet uitgebreid onderzocht.
In tegenstelling tot de goed gedefinieerde solide orgaankenmerken van de menselijke alvleesklier, is de alvleesklier van een muis een diffuus verdeelde zachte weefselachtige structuur17. Daarom wordt het onophoudelijk beïnvloed door fysiologische bewegingen, waaronder peristaltiek en ademhaling. Een eerdere studie over de toepassing van een abdominale beeldvormingsvenster voor de alvleesklier toonde aan dat dwalen plaatsvond als gevolg van bewegingsartefacten veroorzaakt door stoelgang18. Ernstige vervaging werd waargenomen in het resulterende gemiddelde beeld, wat de visualisatie en identificatie van de microschaalstructuren belemmerde.
Hierin beschrijven we het gebruik van een nieuw ondersteunend basis geïntegreerd pancreas intravital imaging venster gecombineerd met intravital microscopie19,20 om de longitudinale cellulaire niveau gebeurtenissen bij ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is te onderzoeken. Naast een gedetailleerde beschrijving van de methodologie in de vorige studie18, zal de uitgebreide toepassing van pancreasbeeldvormingsvenster voor verschillende ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is, in dit document worden behandeld. In dit protocol werd een op maat gemaakt videosnelheidslaserscansysteem voor confocale microscopie gebruikt als een intravital microscopiesysteem. Vier lasermodules (golflengten bij 405, 488, 561 en 640 nm) werden gebruikt als excitatiebron en vier kanalen van emissiesignalen werden gedetecteerd door fotomultiplicatorbuizen (PMT) via bandpassfilters (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestond uit een roterende veelhoekige spiegel (X-as) en een galvanometerscanspiegel (Y-as) die het scannen van videosnelheid mogelijk maakte (30 frames per seconde). Gedetailleerde informatie over intravitale microscopie is beschreven in de vorige studies10,18,19,20,21,22,23.
In onze vorige eilandjesstudie18hebben we met succes en stabiel de eilandjes in levende muizen in beeld brengen met behulp van een transgeen muismodel (MIP-GFP)24 waarin de eilandjes werden getagd met GFP. De methode maakte visualisatie met hoge resolutie van de wijzigingen in de eilandjes over een periode van 1 week mogelijk. Het vergemakkelijkte ook de beeldvorming van dezelfde eilandjes gedurende maximaal 3 weken, wat de haalbaarheid suggereert van langetermijnstudies van de pancreas eilandjes voor het functioneel volgen of monitoren tijdens de pathogenese van diabetes mellitus18. Verder ontwikkelden we een orthotopisch pancreaskankermodel waarbij fluorescerende alvleesklierkankercellen (PANC-1 NucLight Red)25 direct in de alvleesklier van de muis werden geïmplanteerd. Met de toepassing van het pancreas intravital imaging venster, dit model kan worden gebruikt als een platform voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire pathofysiologie in de tumor micro-omgeving van alvleesklierkanker en voor de therapeutische monitoring van nieuwe drug kandidaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol bestaat uit intravitale beeldvorming van de alvleesklier met behulp van een nieuw ondersteunend basis geïntegreerd pancreas intravital imaging venster aangepast vanuit een abdominale imaging venster. Onder de hierboven beschreven protocollen is de eerste kritieke stap de implantatie van het intravitale pancreasbeeldvormingsvenster in de muis. Voor het aanbrengen van de lijm in het raam is het belangrijk om de lijm tussen de rand van het raam en het afdekglas aan te brengen, maar niet op het …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidie nr. 14-2020-002 van het SNUBH Research Fund en door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
Referenzen
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Krebsforschung. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
