Стабилизированная продольная визуализация поджелудочной железы in vivo на клеточном уровне с мышиной моделью с окном приживной визуализации поджелудочной железы
Summary
Визуализация поджелудочной железы in vivo с высоким разрешением облегчалась с помощью окна приживитой визуализации поджелудочной железы.
Abstract
Прямая визуализация поджелудочной железы с клеточным разрешением in vivo в живой модели мелкого животного была технически сложной. Недавнее исследование прижизальной визуализации с окном абдоминальной визуализации позволило визуализировать клеточную динамику в органах брюшной полости in vivo. Однако из-за мягкой листовой архитектуры поджелудочной железы мыши, на которую можно легко повлиять физиологическим движением (например, перистальтикой и дыханием), было трудно выполнять стабилизированную продольную визуализацию in vivo в течение нескольких недель на клеточном уровне для идентификации, отслеживания и количественной оценки островков или раковых клеток в поджелудочной железе мыши. Здесь мы описываем способ имплантации нового поддерживающего основания, интегрированного окна прижизной визуализации поджелудочной железы, которое может пространственно отделять поджелудочную железу от кишечника для продольной покадровой прижизной визуализации микроструктуры поджелудочной железы. Продольная визуализация in vivo с окном визуализации обеспечивает стабильную визуализацию, позволяющую отслеживать островки в течение 3 недель и трехмерную визуализацию микроструктуры с высоким разрешением, о чем свидетельствует ортотопическая модель рака поджелудочной железы. С помощью нашего метода дальнейшие исследования прижизневой визуализации могут прояснить патофизиологию различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой на клеточном уровне.
Introduction
Поджелудочная железа является брюшным органом с экзокринным органом в пищеварительном тракте и эндокринной функцией секретирования гормонов в кровоток. Клеточная визуализация поджелудочной железы с высоким разрешением может выявить патофизиологию различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой, включая панкреатит, рак поджелудочной железы и сахарный диабет1. Обычные диагностические инструменты визуализации, такие как компьютерная томография, визуализация магнитного разрешения и ультрасонография, широко доступны в клиническойобласти 1,2. Однако эти методы визуализации ограничены визуализацией только структурных или анатомических изменений, в то время как изменения на клеточном или молекулярном уровне не могут быть определены. Учитывая, что молекулярные изменения при сахарном диабете или раке поджелудочной железы у человека могут инициироваться более чем за 10 лет до постановки диагноза3,4,выявление заболеваний поджелудочной железы от их молекулярного перехода в латентный период имеет потенциал для обеспечения ранней диагностики и своевременного вмешательства. Таким образом, визуализация, которая преодолеет ограничения разрешения и даст ценную информацию о функции, замечательно привлекает внимание, обеспечивая раннюю диагностику рака поджелудочной железы или расширенную идентификацию изменения островков во время прогрессирования сахарного диабета5.
В частности, с островками, ядерная визуализация, биолюминесцентная визуализация и оптическая когерентная томография были предложены в качестве неинвазивных методов визуализации островков6. Однако разрешение этих методов существенно низкое, с типичными значениями в диапазоне от нескольких десятков до сотен микрометров, что предлагает ограниченную способность обнаруживать изменения на клеточном уровне в островках. С другой стороны, предыдущие исследования островков с высоким разрешением проводились при ex vivo7,8 (например, нарезка или переваривание поджелудочной железы), нефизиологических9 (например, экстериоризация поджелудочной железы) и гетеротопных состояниях10,11,12 (например, имплантация под почечную капсулу, внутри печени и в передней камере глаза), что ограничивает их интерпретацию и клинические последствия. Если in vivo,физиологическая и ортотопическая модель визуализации высокого разрешения может быть установлена, это станет критической платформой для исследования островков поджелудочной железы.
Прижизальная визуализация, которая выявляет патофизиологию на уровне микроскопического разрешения у живого животного, недавно получила большое внимание13. Из методов визуализации in vivo разработка окна абдоминальной визуализации14,которое имплантирует окно в брюшную полость мыши, позволила обнаружить новые результаты (т.е. стадию премикрометастаза раннего метастазирования в печени15 и механизм поддержания стволовых клеток в кишечном эпителии16). Хотя окно абдоминальной визуализации дает ценные результаты, применение этого окна для поджелудочной железы и результирующее исследование прижизальной визуализации, основанное на заболеваниях, связанных с поджелудочной железой, не были широко исследованы.
В отличие от четко определенных характеристик твердых органов поджелудочной железы человека, поджелудочная железа мыши представляет собой диффузно распределенную мягкую тканевую структуру17. Поэтому на него постоянно влияют физиологические движения, включая перистальтику и дыхание. Предыдущее исследование по применению окна абдоминальной визуализации для поджелудочной железы показало, что блуждание происходило из-за артефактов движения, вызванных дефекациями18. В полученном усредненном изображении наблюдалось сильное размытие, что затрудняло визуализацию и идентификацию микромасштабных структур.
Здесь мы описываем использование нового вспомогательного базового интегрированного окна визуализации прижизной поджелудочной железы в сочетании с прижизальной микроскопией19,20 для исследования событий продольного клеточного уровня при заболеваниях, связанных с поджелудочной железой. В дополнение к подробному описанию методологии в предыдущем исследовании18,расширенное применение окна визуализации поджелудочной железы для различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой, будет рассмотрено в этой статье. В этом протоколе в качестве системы прижизностной микроскопии использовалась специально разработанная система лазерного сканирования с частотой видеоснабжений. В качестве источника возбуждения использовались четыре лазерных модуля (длины волн 405, 488, 561 и 640 нм), а четыре канала сигналов излучения были обнаружены фотоумноживательными трубками (PMT) через полосовые фильтры (BPF1: FF01-442/46; БНФ2: ФФ02-525/50; БНФ3: FF01-600/37; БНФ4: FF01-685/40). Лазерное сканирование состояло из вращающегося полигонального зеркала (ось X) и сканирующего зеркала гальванометра (ось Y), что позволяло сканировать видео со скоростью (30 кадров в секунду). Подробная информация о прижизальной микроскопии была описана в предыдущих исследованиях10,18,19,20,21,22,23.
В нашем предыдущем исследованииостровков 18мы успешно и стабильно визуализировали островки у живых мышей, используя трансгенную модель мыши (MIP-GFP)24, в которой островки были помечены GFP. Метод позволил визуализировать изменения в островках с высоким разрешением в течение 1 недели. Это также облегчило визуализацию одних и тех же островков в течение 3 недель, что говорит о целесообразности долгосрочных исследований островков поджелудочной железы для функционального отслеживания или мониторинга во время патогенеза сахарного диабета18. Кроме того, мы разработали ортотопическую модель рака поджелудочной железы, в которой флуоресцентные раковые клетки поджелудочной железы (PANC-1 NucLight Red)25 были непосредственно имплантированы в поджелудочную железу мыши. С применением окна прижизной визуализации поджелудочной железы эта модель может быть использована в качестве платформы для исследования клеточной и молекулярной патофизиологии в микроокружении опухоли рака поджелудочной железы и для терапевтического мониторинга новых кандидатов на лекарства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, состоит из прижизальной визуализации поджелудочной железы с использованием нового вспомогательного базового интегрированного окна визуализации прижизной поджелудочной железы, модифицированного из окна абдоминальной визуализации. Среди протоколов, описа…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом No 14-2020-002 исследовательского фонда SNUBH и грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
Referenzen
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Krebsforschung. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
