Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral
Summary
Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.
Abstract
L’étude des propriétés physiologiques de synapses spécifiques dans le cerveau et de la façon dont elles subissent des changements plastiques est un défi clé dans les neurosciences modernes. Les techniques électrophysiologiques in vitro traditionnelles utilisent la stimulation électrique pour évoquer la transmission synaptique. Un inconvénient majeur de cette méthode est sa nature non spécifique; Tous les axones de la région de l’électrode stimulante seront activés, ce qui rendra difficile l’attribution d’un effet à une connexion afférente particulière. Ce problème peut être surmonté en remplaçant la stimulation électrique par une stimulation optogénétique. Nous décrivons une méthode pour combiner l’optogénétique avec des enregistrements in vitro patch-clamp. Il s’agit d’un outil puissant pour l’étude de la transmission synaptique basale et de la plasticité synaptique des connexions synaptiques anatomiquement définies avec précision et est applicable à presque toutes les voies du cerveau. Ici, nous décrivons la préparation et la manipulation d’un vecteur viral codant pour la protéine channelrhodopsine pour injection chirurgicale dans une région d’intérêt pré-synaptique (cortex préfrontal médial) dans le cerveau des rongeurs et la fabrication de tranches aiguës de régions cibles en aval (cortex entorhinal latéral). Une procédure détaillée pour combiner des enregistrements patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique à court et à long terme est également présentée. Nous discutons d’exemples d’expériences qui atteignent la spécificité de la voie et de la cellule en combinant l’optogénétique et le marquage cellulaire Cre-dépendant. Enfin, la confirmation histologique de la région d’intérêt pré-synaptique est décrite avec le marquage biocytine de la cellule post-synaptique, afin de permettre une identification plus approfondie de l’emplacement précis et du type de cellule.
Introduction
Comprendre la physiologie des synapses et comment elles subissent des changements plastiques est fondamental pour comprendre comment les réseaux cérébraux fonctionnent dans le cerveau sain1, et comment ils fonctionnent mal dans les troubles cérébraux. L’utilisation de tranches cérébrales ex vivo aiguës permet d’enregistrer l’activité électrique des synapses à partir de neurones individuels avec un rapport signal sur bruit élevé à l’aide d’enregistrements patch-clamp à cellules entières. Le contrôle du potentiel membranaire et la manipulation pharmacologique directe permettent d’isoler les sous-types de récepteurs. Ces enregistrements peuvent être réalisés avec une spécificité exquise pour identifier le neurone post-synaptique, y compris la position laminaire et sous-régionale2, la morphologie cellulaire3, la présence de marqueurs moléculaires4, ses projections afférentes5, ou même s’il était récemment actif6.
Atteindre la spécificité des entrées pré-synaptiques est, cependant, un peu plus difficile. La méthode conventionnelle a utilisé des électrodes de stimulation pour exciter les axones qui courent dans une lame particulière. Un exemple de ceci est dans l’hippocampe où la stimulation locale dans la strate radiane active les synapses qui se projettent du CA3 au sous-champ CA17. Dans ce cas, la spécificité présynaptique est atteinte car l’entrée CA3 représente la seule entrée excitatrice située dans la strate radiale qui se projette vers les cellules pyramidales CA18. Ce haut degré de spécificité d’entrée réalisable avec l’activation électrique présynaptique conventionnelle des axones CA3-CA1 est cependant une exception qui se reflète dans l’étude intense à laquelle cette synapse a été soumise. Dans d’autres régions du cerveau, les axones de plusieurs voies afférentes coexistent dans la même lame, par exemple dans la couche 1 du néocortex9, rendant ainsi impossible la stimulation présynaptique spécifique à l’entrée avec des électrodes de stimulation conventionnelles. Ceci est problématique car différentes entrées synaptiques peuvent avoir des propriétés physiologiques divergentes; Par conséquent, leur co-stimulation peut conduire à une mauvaise caractérisation de la physiologie synaptique.
L’avènement de l’optogénétique, le codage génétique de protéines membranaires photosensibles (opsines) telles que la channelrhodopsine-2 (ChR2), a permis une vaste expansion des possibilités d’étude des projections synaptiques isolées entre les régions du cerveau10,11. Nous décrivons ici une solution généralisable et peu coûteuse pour étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme. Les constructions optogénétiques sont délivrées de manière très spécifique à l’aide de vecteurs viraux permettant un contrôle extrêmement précis de la région pré-synaptique d’intérêt. Les projections efférentes exprimeront le canal activé par la lumière permettant l’activation de ces fibres dans une région cible. Ainsi, les voies anatomiquement diffuses à longue portée qui ne peuvent pas être activées indépendamment par une stimulation électrique traditionnelle et non spécifique peuvent être étudiées.
Nous décrivons, à titre d’exemple, la transduction du cortex préfrontal médian (mPFC) avec des virus adéno-associés (AAV) codant pour les opsines des canaux cationiques excitateurs. Nous décrivons ensuite la préparation de tranches aiguës à partir du cortex entorhinal latéral (LEC), les enregistrements patch-clamp des neurones pyramidaux LEC de couche 5 et l’activation évoquée par la lumière des projections glutamatergiques mPFC-LEC (Figure 1). Nous décrivons également l’évaluation histologique du site d’injection pour confirmer l’emplacement de la région d’intérêt pré-synaptique et l’identification de la morphologie cellulaire post-synaptique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici décrit une méthode pour explorer des projections synaptiques à longue distance très spécifiques en utilisant une combinaison de chirurgie stéréotaxique pour délivrer des AAV codant pour des constructions optogénétiques et d’électrophysiologie dans des coupes cérébrales aiguës (Figure 1). Ensemble, ces techniques offrent des outils pour caractériser la physiologie et la plasticité des circuits cérébraux avec une grande précision dans des voies …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la subvention Wellcome 206401/Z/17/Z. Nous tenons à remercier Zafar Bashir pour son mentorat expert et le Dr Clair Booth pour son assistance technique et ses commentaires sur le manuscrit.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Referenzen
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