エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ
Summary
ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。
Abstract
脳内の特定のシナプスの生理学的特性と、それらがどのように可塑性変化を受けるかを研究することは、現代の神経科学における重要な課題です。従来の in vitro 電気生理学的手法は、電気刺激を使用してシナプス伝達を誘発します。この方法の主な欠点は、その非特異的な性質です。刺激電極の領域内のすべての軸索が活性化され、効果を特定の求心性結合に帰することを困難にする。この問題は、電気刺激を光遺伝学ベースの刺激に置き換えることで克服できます。オプトジェネティクスと in vitro パッチクランプ記録を組み合わせる方法について説明します。これは、解剖学的に定義された正確なシナプス接続の基礎シナプス伝達とシナプス可塑性の両方を研究するための強力なツールであり、脳内のほぼすべての経路に適用できます。ここでは、げっ歯類脳の目的のシナプス前領域(内側前頭前野)への外科的注射のためのチャネルロドプシンタンパク質をコードするウイルスベクターの調製と取り扱い、および下流の標的領域(外側嗅内皮質)の急性スライスの作成について説明します。パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、短期および長期のシナプス可塑性を研究するための詳細な手順も提示されます。光遺伝学とCre依存性細胞標識を組み合わせることで経路特異性や細胞特異性を実現する実験例について議論する。最後に、目的のシナプス前領域の組織学的確認は、シナプス後細胞のビオシチン標識と共に記載され、正確な位置および細胞型のさらなる同定を可能にする。
Introduction
シナプスの生理機能や可塑性変化を理解することは、健康な脳1で脳ネットワークがどのように機能し、脳障害でどのように機能不全になるかを理解するための基本です。急性 ex vivo 脳スライスの使用は、全細胞パッチクランプ記録を使用して、高い信号対雑音比で単一ニューロンからのシナプスの電気的活動の記録を可能にする。膜電位の制御と簡単な薬理学的操作により、受容体サブタイプの単離が可能になります。これらの記録は、層流および亜領域位置2、細胞形態3、分子マーカーの存在4、その求心性突起5、または最近活動的であった場合でも、シナプス後ニューロンを識別するための絶妙な特異性で行うことができます6。
しかし、シナプス前入力の特異性を達成することは、やや困難です。従来の方法では、刺激電極を使用して、特定の椎弓板を走る軸索を励起していました。この例は海馬で、放射状層の局所刺激がCA3からCA1サブフィールド7に投射するシナプスを活性化します。この場合、シナプス前特異性は、CA3入力がCA1錐体細胞8に突出する放射状層内に位置する唯一の興奮性入力を表すため、達成される。しかし、CA3-CA1軸索の従来の電気的シナプス前活性化で達成可能なこの高度な入力特異性は、このシナプスが受けてきた熱心な研究に反映されている例外です。他の脳領域では、複数の求心性経路からの軸索が同じ椎弓板、たとえば新皮質9の層1に共存しているため、従来の刺激電極では入力特異的なシナプス前刺激が不可能になります。異なるシナプス入力が異なる生理学的特性を有する可能性があるため、これは問題である。したがって、それらの共刺激はシナプス生理学の誤った特徴付けにつながる可能性があります。
チャネルロドプシン-2(ChR2)などの感光性膜タンパク質(オプシン)の遺伝的コードであるオプトジェネティクスの出現により、脳領域間の孤立したシナプス投影を研究する可能性が大幅に拡大しました10,11。ここでは、長距離シナプス生理学と可塑性を研究するための一般化可能で低コストのソリューションについて説明します。光遺伝学的構築物は、ウイルスベクターを使用して非常に特異的な方法で送達され、目的のシナプス前領域の非常に正確な制御を可能にします。遠心性突起は、ターゲット領域でこれらの繊維の活性化を可能にする光活性化チャネルを表現します。したがって、従来の非特異的な電気刺激では独立して活性化できない長距離の解剖学的に拡散した経路を研究することができます。
我々は、経路の例として、興奮性陽イオンチャネルオプシンをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)による内側前頭前野(mPFC)の形質導入について説明する。次に、外側嗅内皮質(LEC)からの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびグルタミン酸作動性mPFC-LEC突起の光誘発活性化について説明します(図1)。また、シナプス前関心領域の位置を確認するための注射部位の組織学的評価とシナプス後細胞の形態の同定についても説明します。
Protocol
すべての動物の手順は、英国動物科学手順法(1986)および関連するガイドライン、および地域の機関ガイドラインに従って実施されました。 1.脳定位固定装置ウイルス注射 注:現在のプロトコルでは、解剖学的ですが、シナプス後細胞型の特異性は必要ありません。 適切な動物を選択してください。このプロトコルでは、雄の野生?…
Representative Results
このプロトコルでは、光遺伝学的構築物のウイルス送達を使用して、長距離シナプス生理学と可塑性を研究する方法について説明します。このプロトコルは、脳内のほぼすべての長距離接続の研究に非常に簡単に適応できます。一例として、ラットmPFCへのオプシンをコードするAAVの注入、LECからの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびLECにおけ?…
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、光遺伝学的構築物をコードするAAVを送達する定位固定手術と急性脳スライスにおける電気生理学の組み合わせを使用して、高度に特異的な長距離シナプス投影を探索する方法を説明しています(図1)。これらの技術を組み合わせることで、従来の非特異的な電気刺激ではアクセスできなかった長距離および解剖学的に拡散した経路において?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、Wellcome grant 206401/Z/17/Zによってサポートされています。Zafar Bashir 氏の専門家による指導と、技術支援と原稿へのコメントを提供してくれた Clair Booth 博士に感謝します。
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Referenzen
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neurowissenschaften. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
Diesen Artikel zitieren
Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (180), e63077, doi:10.3791/63077 (2022).