Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale
Summary
Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.
Abstract
Studiare le proprietà fisiologiche di specifiche sinapsi nel cervello e come subiscono cambiamenti plastici è una sfida chiave nelle moderne neuroscienze. Le tradizionali tecniche elettrofisiologiche in vitro utilizzano la stimolazione elettrica per evocare la trasmissione sinaptica. Uno dei principali svantaggi di questo metodo è la sua natura non specifica; Tutti gli assoni nella regione dell’elettrodo stimolante saranno attivati, rendendo difficile attribuire un effetto a una particolare connessione afferente. Questo problema può essere superato sostituendo la stimolazione elettrica con la stimolazione basata sull’optogenetica. Descriviamo un metodo per combinare l’optogenetica con registrazioni di patch clamp in vitro . Questo è un potente strumento per lo studio sia della trasmissione sinaptica basale che della plasticità sinaptica di precise connessioni sinaptiche anatomicamente definite ed è applicabile a quasi tutti i percorsi nel cervello. Qui, descriviamo la preparazione e la gestione di un vettore virale che codifica la proteina channelrhodopsin per l’iniezione chirurgica in una regione pre-sinaptica di interesse (corteccia prefrontale mediale) nel cervello dei roditori e la produzione di fette acute di regioni bersaglio a valle (corteccia entorinale laterale). Viene inoltre presentata una procedura dettagliata per combinare le registrazioni patch-clamp con l’attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica a breve e lungo termine. Discutiamo esempi di esperimenti che raggiungono la specificità del percorso e della cellula combinando l’optogenetica e l’etichettatura cellulare Cre-dipendente. Infine, viene descritta la conferma istologica della regione pre-sinaptica di interesse insieme alla marcatura della biocitina della cellula post-sinaptica, per consentire un’ulteriore identificazione della posizione precisa e del tipo di cellula.
Introduction
Comprendere la fisiologia delle sinapsi e come subiscono cambiamenti plastici è fondamentale per capire come funzionano le reti cerebrali nel cervello sano1 e come funzionano male nei disturbi cerebrali. L’uso di fette cerebrali acute ex vivo consente la registrazione dell’attività elettrica delle sinapsi da singoli neuroni con un elevato rapporto segnale-rumore utilizzando registrazioni patch-clamp a cellule intere. Il controllo del potenziale di membrana e la semplice manipolazione farmacologica consentono l’isolamento dei sottotipi recettoriali. Queste registrazioni possono essere fatte con squisita specificità per identificare il neurone post-sinaptico, compresa la posizione laminare e sub-regionale2, la morfologia cellulare3, la presenza di marcatori molecolari4, le sue proiezioni afferenti5, o anche se era recentemente attivo6.
Raggiungere la specificità degli input pre-sinaptici è, tuttavia, un po ‘più impegnativo. Il metodo convenzionale ha utilizzato elettrodi di stimolazione per eccitare gli assoni che corrono in una particolare lamina. Un esempio di questo è nell’ippocampo dove la stimolazione locale nello strato radiato attiva sinapsi che proiettano dal CA3 al sottocampo CA17. In questo caso, la specificità presinaptica è raggiunta in quanto l’input CA3 rappresenta l’unico input eccitatorio situato all’interno dello strato radiato che proietta alle cellule piramidali CA18. Questo elevato grado di specificità di input ottenibile con l’attivazione presinaptica elettrica convenzionale degli assoni CA3-CA1 è, tuttavia, un’eccezione che si riflette nell’intenso studio a cui questa sinapsi è stata soggetta. In altre regioni del cervello, assoni provenienti da più vie afferenti coesistono nella stessa lamina, ad esempio nello strato 1 della neocorteccia9, rendendo così impossibile la stimolazione presinaptica specifica dell’input con elettrodi stimolanti convenzionali. Questo è problematico in quanto diversi input sinaptici possono avere proprietà fisiologiche divergenti; Pertanto, la loro co-stimolazione può portare a un’errata caratterizzazione della fisiologia sinaptica.
L’avvento dell’optogenetica, la codifica genetica delle proteine di membrana fotosensibili (opsine) come la channelrhodopsin-2 (ChR2), ha permesso una vasta espansione delle possibilità di studio delle proiezioni sinaptiche isolate tra le regioni cerebrali10,11. Qui descriviamo una soluzione generalizzabile e a basso costo per studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità. I costrutti optogenetici sono forniti in modo altamente specifico utilizzando vettori virali che consentono un controllo estremamente preciso della regione pre-sinaptica di interesse. Le proiezioni efferenti esprimeranno il canale attivato dalla luce consentendo l’attivazione di queste fibre in una regione target. Pertanto, possono essere studiati percorsi anatomicamente diffusi a lungo raggio che non possono essere attivati in modo indipendente dalla stimolazione elettrica tradizionale, non specifica.
Descriviamo, come percorso esemplificativo, la trasduzione della corteccia prefrontale mediale (mPFC) con virus adeno-associati (AAV) che codificano opsine eccitatorie dei canali cationici. Descriviamo quindi la preparazione di fette acute dalla corteccia entorinale laterale (LEC), registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce delle proiezioni glutammatergiche mPFC-LEC (Figura 1). Descriviamo anche la valutazione istologica del sito di iniezione per confermare la posizione della regione pre-sinaptica di interesse e l’identificazione della morfologia cellulare post-sinaptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per esplorare proiezioni sinaptiche a lungo raggio altamente specifiche utilizzando una combinazione di chirurgia stereotassica per fornire AAV che codificano costrutti optogenetici ed elettrofisiologia in fette di cervello acute (Figura 1). Insieme, queste tecniche offrono strumenti per caratterizzare la fisiologia e la plasticità dei circuiti cerebrali con alta precisione in percorsi a lungo raggio e anatomicamente diffusi che in precedenza …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto dalla sovvenzione Wellcome 206401/Z/17/Z. Vorremmo ringraziare Zafar Bashir per il suo tutoraggio esperto e il Dr. Clair Booth per l’assistenza tecnica e i commenti sul manoscritto.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Referenzen
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