Dit protocol beschrijft een methode om reproduceerbare, kleinschalige gemanipuleerde longweefsels te genereren, door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken opnieuw te bevolken met alveolaire epitheliale type 2-cellen, fibroblasten en endotheelcellen.
Er is behoefte aan verbeterde 3-dimensionale (3D) longmodellen die de architecturale en cellulaire complexiteit van de inheemse longalveolus ex vivo samenvatten. Recent ontwikkelde organoïde modellen hebben de uitbreiding en studie van longepitheelvoorlopers in vitro vergemakkelijkt, maar deze platforms vertrouwen meestal op van muizentumor afgeleide matrix en / of serum en bevatten slechts één of twee cellulaire afstammingslijnen. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van gemanipuleerde longweefsels (ELTs) op basis van de multi-lineage recellularisatie van gedecellulariseerde precisie-gesneden longplakken (PCLS). ELTs bevatten alveolaire structuren bestaande uit alveolair epitheel, mesenchym en endotheel, binnen een extracellulair matrix (ECM) substraat dat sterk lijkt op dat van de inheemse long. Om de weefsels te genereren, worden rattenlongen opgeblazen met agarose, gesneden in 450 μm dikke plakken, in stroken gesneden en gedecellulariseerd. De resulterende acellulaire ECM-steigers worden vervolgens opnieuw ingezaaid met primaire endotheelcellen, fibroblasten en alveolaire epitheliale type 2-cellen (AEC2s). AEC2s kunnen gedurende ten minste 7 dagen in ELT-cultuur worden gehouden met een serumvrij, chemisch gedefinieerd groeimedium. Tijdens het weefselvoorbereidings- en kweekproces worden de plakjes in een cassettesysteem geknipt dat de verwerking en gestandaardiseerde celzaaiing van meerdere ELT’s parallel vergemakkelijkt. Deze ELTs vertegenwoordigen een organotypisch kweekplatform dat onderzoek naar cel-cel- en cel-matrixinteracties binnen de alveolus moet vergemakkelijken, evenals biochemische signalen die AEC2’s en hun niche reguleren.
Longblaasjes zijn de functionele eenheden van de distale long, bestaande uit een maaswerk van gasuitwisselingsruimten omzoomd door alveolaire epitheliale type 1-cellen (AEC1s) en type 2-cellen (AEC2s). Onderliggend aan het epitheel ligt een dicht netwerk van haarvaten en ondersteunend mesenchym, allemaal ondersteund door een extracellulaire matrix (ECM) steiger die zowel sterkte als flexibiliteit biedt aan deze delicate luchtzakken1. De longblaasjes zijn ook de plaats van letsel in tal van longpathologieën, waaronder idiopathische longfibrose2, acute respiratory distress syndrome3 en ernstige coronavirusziekte-19 (COVID-19)4. Hoewel het werk in het afgelopen decennium een opmerkelijke plasticiteit in het longepitheel heeft blootgelegd, blijven de mechanismen die distale longreparatie in sommige omgevingen mogelijk maken – en die reparatie in andere uitsluiten – een gebied van intensief onderzoek5. De ontwikkeling van verbeterde in vitro platforms om de alveolus te modelleren zou studies van alveolaire biologie, regeneratie en therapeutica vergemakkelijken.
AEC2’s vernieuwen zichzelf en differentiëren in AEC1’s en worden dus beschouwd als de primaire stamcel van de distale long 6,7,8. Deze cellen vormen echter een bijzondere uitdaging voor in vitro studie gezien de moeilijkheden die gepaard gaan met het kweken van primaire AEC2’s zonder verlies van fenotype9. In conventionele 2-dimensionale (2D) cultuur vlakken AEC2’s af en nemen ze enkele kenmerken van AEC1-achtige cellen10 aan. Daarentegen ondersteunen 3D-kweekstrategieën, meestal organoïden, het behoud van gedifferentieerde kenmerken in primaire AEC2s 6,11,12 en maken langdurige kweek van pluripotente stamcel (PSC) -afgeleide AEC2s13,14 mogelijk. Organoïden zijn gebruikt om distale longontwikkeling15, virale infectie11,15 en AEC2-gerelateerde genetische ziekte 13,16,17 te modelleren, waardoor belangrijke inzichten in AEC2-biologie en regeneratie mogelijk worden. Deze kweekmodellen bestaan echter meestal uit slechts één of twee cellulaire afstammingslijnen en integreren de cellen in gel-type matrices die de architectuur of het ECM-substraat van de inheemse longalveolus niet kunnen samenvatten.
De ECM is een kritische regulator van celfenotype en gedrag via moleculaire, topologische en mechanische signalen; omvat een belangrijk onderdeel van weefselspecifieke niches die het lot van stamcellen reguleren; en dient als een reservoir dat de beschikbaarheid van lokaal uitgescheiden groeifactorenmoduleert 18,19,20,21. Het kweken van cellen op inheemse ECM kan dus het voorspellend vermogen van in vitro systemen vergroten om de biologie van in vivo weefsels te modelleren. Decellularisatie, een proces dat cellulair materiaal uit weefsels verwijdert via detergentia, enzymen of fysieke of andere methoden, kan de ECM-steigers van een inheems orgaan grotendeels behouden, wanneer zorgvuldig uitgevoerd22,23. Dergelijke steigers kunnen opnieuw worden bevolkt met cellen voor 3D-biomimetische cultuur. Hoewel gedecelluliseerde steigers veel worden gebruikt voor weefselmanipulatietoepassingen, is het gebruik ervan voor routinematige celkweek beperkt. Verschillende eerdere studies hebben de decellularisatie en recellularisatie van longplakken of kleine longweefselsegmenten gemeld. Naast proof-of-concept studies 24,25,26, zijn herbevolkte longplakken gebruikt om fibroblast-matrix adhesie 27,28 te bestuderen en om het effect van zieke longmatrices op fibroblastfenotype27,29 te onderzoeken. Met verbeterde technologieën die beschikbaar zijn voor het genereren van nauwkeurig gesneden weefselplakken, kunnen gedecellulariseerde longplakken een handig en kleinschalig platform bieden om cellen te kweken, met behoud van alveolaire, luchtweg- en vasculaire substructuren. Het opnemen van meerdere celtypen zou studies van cel-celinteracties binnen een fysiologisch relevante 3D-omgeving mogelijk maken. Er zijn echter verbeterde strategieën nodig om de behandeling van weefsels tijdens het kweekproces te vergemakkelijken en om te zorgen voor gecontroleerde en reproduceerbare zaaiing van weefsels met bekende aantallen cellen.
Hier presenteren we een protocol om gemanipuleerde longweefsels (ELTs) te genereren door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken (PCLS) opnieuw te bevolken met primaire endotheelcellen, AEC2’s en fibroblasten. In een aanpassing van ons eerder beschreven gemanipuleerde hartweefselsysteem30 en hele longdecellularisatie-recellularisatiestrategieën 22,31, beschrijven we procedures om PCLS uit rattenlongen te snijden en de plakjes in herbruikbare weefselkweekcassettes te knippen die downstream-manipulaties vereenvoudigen en standaardiseren. Geknipte plakjes worden gedecellulariseerd om acellulaire ECM-steigers te vormen, die opnieuw worden bevolkt in aangepaste zaaibaden. Long slice scaffolds behouden kritische ECM-componenten en architectuur en ondersteunen de groei van AEC2’s binnen multi-lineage alveolaire-achtige structuren gedurende ten minste 7 dagen. ELTs vertegenwoordigen een nieuw alveolair co-kweeksysteem binnen een fysiologisch relevante 3D-matrix, die de ontwikkeling van longweefseltechnologiestrategieën moet ondersteunen en tegelijkertijd fundamentele biologische studies van AEC2s en de alveolus moet vergemakkelijken.
Dit artikel beschrijft het gebruik van gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken als een platform om in vitro gemanipuleerde longweefsels te genereren, die alveolaire structuren met meerdere afstammingslijnen bevatten. Door strategieën te combineren die we eerder hebben ontwikkeld om high-fidelity acellulaire ECM-longsteigers voor hele longtechnologie22,31 opnieuw te bevolken met ons robuuste systeem voor het kweken van kleinschalige gemanipuleerde hartweefsels30, maakt dit protocol het gebruik van fysiologisch relevante long-ECM als weefselkweeksubstraat mogelijk, op een herhaalbare en matige doorvoer.
De hier gepresenteerde methoden beschrijven ELT-steigerpreparaat uit rattenlongen, die gemakkelijk haalbaar zijn, kunnen worden geëxtraheerd met directe toegang tot intacte luchtwegen voor agarose-inflatie en zijn van grotere omvang dan muizenlong. Elk longweefsel dat kan worden opgeblazen met agarose en plakjes van ten minste 9 mm lang, mag echter binnen dit systeem worden gebruikt. Ongeacht de weefselbron is uniforme inflatie van het longweefsel met agarose de meest kritieke stap om het succes van downstream weefselsnijden, knippen en weefselbehandeling te garanderen. Ondergepompt longweefsel heeft de neiging om niet schoon te snijden, terwijl overgepompt weefsel kan scheuren tijdens het knippen. Na agarose-gelatatie zijn op de juiste opgeblazen weefselgebieden stevig, maar geven ze een beetje wanneer ze zachtjes met een tang worden ingedrukt. Voor intacte rattenlongen ontdekten we dat het meerdere keren opblazen van de geëxtraheerde longen met lucht, gevolgd door agarose-inflatie zo snel mogelijk na extractie, resulteert in de beste snijresultaten en de beste kwaliteit van de resulterende weefselsteigers. Het juiste volume agarose moet empirisch worden geoptimaliseerd; voor een rattenlong is het volume dat nodig is om de long op te blazen tot de totale longcapaciteit ongeveer 30 ml/kg dierlijke massa (bijv. 10,5 ml agarose voor longen van een rat van 350 g). Voor grotere gereseceerde longweefsels met minder eenvoudige toegang tot de luchtwegen (zoals die van menselijke donoren), kan enige aanvullende probleemoplossing nodig zijn om het weefsel op te blazen via een bronchus32. Tijdens het daaropvolgende longsnijden is de selectie en oriëntatie van het weefsel op de zuiger een andere belangrijke stap om 1) ervoor te zorgen dat de plakjes groot genoeg zijn om weefselstroken te genereren die in weefselkweekcassettes kunnen worden geknipt en 2) parenchymaal (alveolair) weefselgebied te maximaliseren, met uitzondering van grote luchtwegen of bloedvaten.
Het knippen van de PCLS in weefselkweekcassettes kan in eerste instantie een uitdagende stap zijn, maar de cassettes vereenvoudigen de weefselverwerking tijdens decellularisatie en zaaien aanzienlijk. Twee mogelijke problemen die zich kunnen voordoen zijn weefselscheuren (tijdens het proces van knippen of tijdens decellularisatie), of weefselpositionering in de clips die resulteert in slecht stroomafwaarts zaaien (bijvoorbeeld geen zaaien of zaaien alleen aan de uiteinden). Scheuren kan het gevolg zijn van agarose overinflatie, overbelasting van het weefsel tijdens het inbrengen van tabs of het achterlaten van te weinig overhang om voldoende weefselgreep te bieden bij het inbrengen van de lipjes. Merk op dat plakjes die aan één clipuiteinde scheuren met succes kunnen worden gezaaid, maar ze zijn moeilijk te visualiseren onder de microscoop tijdens het kweken omdat het weefsel niet plat is. Slechte weefselzaaiing (zoals die in figuur 6C) is waarschijnlijk het gevolg van het feit dat het plakje niet plat tussen de twee clips ligt en dus slecht contact maakt met de basis van het zaaibad wanneer het ondersteboven wordt gekeerd. Een andere mogelijke oorzaak is het onjuist plaatsen van de cassette in de bodem van het zaaibadput. In termen van knippen, breng iets meer spanning in het weefsel aan bij het plaatsen van de tweede clip om het plat te laten liggen. Sommige plakjes hebben een lichte concaviteit; knip in deze gevallen het plakje met de bolle kant naar boven. Met oefening ervaren we meestal mislukt zaaien met minder dan 2% van de plakjes.
Een beperking van dit protocol is de vereiste voor sommige gespecialiseerde apparatuur – een lasersnijder en een 3D-printer – om de eerste materialen voor ELT-voorbereiding te genereren. Zodra de weefselkweekcassettes en zaaibaden zijn gemaakt, zijn er echter geen extra speciale materialen nodig. De longsnij- en decellularisatiestappen van ELT-steigervoorbereiding zijn matig tijdrovend; deze stappen kunnen echter van tevoren worden uitgevoerd, of in aantallen die voldoende zijn om zich voor te bereiden op meerdere experimenten tegelijkertijd. Veel PCLS (>100 als optimaliseren voor parenchymale regio’s) kunnen uit een enkele long worden gesneden en worden ingevroren voor later gebruik. Hoewel een enkele vries-dooicyclus kleine ultrastructurele schade aan de ECU46 kan veroorzaken, is aangetoond dat zelfs meerdere vries-dooicycli geen significant verlies in ECU23,47 veroorzaken. PCLS kan ook worden geknipt en gedecellulariseerd voorafgaand aan een experiment, om binnen een maand te worden gebruikt. (Met name kan het beschreven decellularisatieprotocol in ongeveer 6 uur worden bereikt, wat een aanzienlijk voordeel vertegenwoordigt ten opzichte van eerder beschreven methoden die een dag of meervereisen 27,28.) Zodra de steigers zijn voorbereid, is het celzaaiproces eenvoudig en snel en vereist de cultuur van ELTs geen gespecialiseerde technieken.
Een voorbehoud bij de beschreven ELT-methode is het ontbreken van regiospecifieke zaaiing, d.w.z. de levering van AEC2’s specifiek aan de alveolaire ruimte, of endotheelcellen specifiek aan de vasculaire ruimte. Niettemin, hoewel cellen eenvoudig bovenop de weefselsteigers worden gezaaid, is het patroon van recellularisatie niet-willekeurig, met enige schijn van alveolaire organisatie, inclusief epitheliale ringen. We vermoeden dat cel-celinteracties, evenals lokale verschillen in ECM-samenstelling en geometrie20,21, waarschijnlijk bijdragen aan de waargenomen recellularisatiepatronen. Ter ondersteuning van deze hypothese toonde een eerder gepubliceerde studie, waarin fibroblasten niet-specifiek op gedecellulariseerde longplakken werden gezaaid, aan dat het patroon van weefselherbevolking en geassocieerde cellulaire fenotypen significant varieerde per microscopisch weefselgebied en ECM-steigerbron (bijv. Gezond versus ziek)27. Fibroblasten werden ook waargenomen om binnen te dringen in het interstitium – de locatie waar ze zich in het inheemse longweefsel bevinden 1,27. De primaire alternatieve methode die we ons kunnen voorstellen om cellen op longplakken op een echt regiospecifieke manier te kweken, zou inhouden dat intacte gedecellulariseerde longen via de luchtwegen31,48 en vasculaire compartimenten 49,50 wordengezaaid en vervolgens het gerecellulariseerde weefsel wordt gesneden. Dit alternatief 1) is echter aanzienlijk kosten-, tijd- en middelenintensiever; 2) is lagere doorvoer; 3) vereist een groter aantal dieren; en 4) wordt geassocieerd met een verhoogd risico op besmetting als gevolg van de uitdagingen van de hele longkweek en het daaropvolgende snijden van de gezaaide long. Hoewel het ELT-platform niet alle aspecten van native cellulaire organisatie samenvat, maakt het longcelkweek mogelijk op een fysiologisch relevant ECM-substraat, op een manier die toegankelijk is voor veel meer laboratoria.
De flexibiliteit van het ELT-systeem is een groot voordeel van dit platform en zou kleinschalige longweefselkweek met een willekeurig aantal weefselsteigers, cellen of kweekmedia van belang moeten maken. Het gebruik van steigers afgeleid van ziek weefsel of van verwondingsmodellen kan de studie van cel-cel- of cel-matrixinteracties in de setting van ziekteveranderde ECM 27,29,51 mogelijk maken. Houd er echter rekening mee dat het decellularisatieprotocol mogelijk moet worden aangepast om rekening te houden met matrixverschillen tussen soorten52. De beschreven zaaistrategie kan voor elk celtype worden gebruikt en de kweektijdlijn kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Als uitgangspunt geldt dat 1 x 106 cellen per steiger binnen 7 dagen na kweek een zeer cellulair weefsel moeten opleveren, terwijl 1 x 105 totale cellen resulteren in een slechte cellulariteit. Bij elke aanpassing van de tijdlijn moeten de weefselkweekcassettes 24 uur na het laatste zaaien uit het zaaibad worden verwijderd. Hier, met het doel om een deel van de cellulaire complexiteit van de longalveolus te modelleren, beschrijven we een tri-cultuur recellularisatiestrategie die het onderhoud van goed gedifferentieerde neonatale AEC2’s in alveolaire structuren gedurende ten minste 7 dagen ondersteunt. Onze resultaten tonen ook de succesvolle engraftment van zowel fibroblasten als endotheelcellen binnen ELTs, waarbij de brede toepasbaarheid van het kweeksubstraat en de geschiktheid ervan voor co-kweekstudies wordt benadrukt. Het zaaien van volwassen cellen in ELTs kan de modellering van meer rustige alveolaire structuren vergemakkelijken, terwijl het zaaien van van menselijke PSC afgeleide AEC2’s, inclusief die met genetische modificaties, translationele studies van menselijke ziekten zou kunnen vergemakkelijken13,53. Over het algemeen biedt de bottom-upbenadering die mogelijk wordt gemaakt door het ELT-platform de mogelijkheid om de bijdragen van bepaalde celtypen aan uitlezingen van belang te onderzoeken – zoals AEC2-proliferatie of differentiatietoestand.
Samenvattend schetst dit protocol een robuust systeem voor het genereren van gemanipuleerde longweefsels voor co-kweekstudies van AEC2’s, fibroblasten en endotheelcellen in acellulaire ECM-longschijfsteigers. ELTs vertegenwoordigen een nieuwe 3D-cultuurstrategie voor primaire AEC2’s, die tot nu toe meestal hebben vertrouwd op minder fysiologische gel-type matrices om een goed gedifferentieerd fenotype 6,11,12 te behouden. Het huidige platform bouwt voort op eerder werk in de herbevolking van gedecellulariseerde longplakken 24,25,26,27,28,29, maar biedt verschillende voordelen: 1) een weefselkweekcassettesysteem om ELT-behandeling tijdens decellularisatie, zaaien en kweken te vergemakkelijken; 2) een aangepast zaaibad om nauwkeurig een bekend aantal cellen op elke plaksteiger te zaaien; en 3) een tri-kweek herzaaistrategie die alveolaire weefselherbevolking met epitheliale, mesenchymale en endotheelcellen mogelijk maakt. ELTs vertegenwoordigen dus een belangrijke stap voorwaarts in de richting van het creëren van reproduceerbare in vitro modellen die de cellulaire en substraatcomplexiteit van de inheemse alveolus en de AEC2-stamcelniche vastleggen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Lorenzo Sewanan en Jorge Nunez bedanken voor hun werk bij het ontwikkelen van het weefselkweekcassetteontwerp dat in dit protocol wordt gebruikt, het Kaminski-lab voor het gebruik van hun vibratome, Maurizio Chioccioli en Jessica Nouws voor hulp bij het snijden van longen, Allie LaRocco voor hulp bij de eerste pilootexperimenten en Hong Qian voor het zorgvuldig lezen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies F30HL143880 (K.L.L.), de Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) en U01HL145567 (L.E.N.); en door een onbeperkte onderzoeksgift van Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |