이 프로토콜은 탈세포화된 정밀 절단된 폐 조각을 폐포 상피 유형 2 세포, 섬유아세포 및 내피 세포로 재채움으로써 재현 가능한 소규모 조작된 폐 조직을 생성하는 방법을 설명합니다.
천연 폐포 ex 생체의 건축 및 세포 복잡성을 재조정하는 개선된 3차원(3D) 폐 모델에 대한 필요성이 존재한다. 최근에 개발된 오가노이드 모델은 시험관 내에서 폐 상피 전구물질의 확장 및 연구를 촉진시켰지만, 이들 플랫폼은 전형적으로 마우스 종양 유래 매트릭스 및/또는 혈청에 의존하고, 단지 하나 또는 두 개의 세포 혈통을 통합한다. 여기에서, 우리는 탈세포화 정밀 절단 폐 절편 (PCLS)의 다중 계보 재세포화에 기초하여 조작된 폐 조직 (ELTs)을 생성하기 위한 프로토콜을 설명한다. ELT는 폐포 상피, 중간엽 및 내피를 포함하는 폐포 유사 구조를 함유하며, 이는 천연 폐와 매우 유사한 세포외 매트릭스(ECM) 기질 내에 있습니다. 조직을 생성하기 위해 쥐 폐는 아가로스로 팽창되고, 450 μm 두께의 조각으로 슬라이스되고, 스트립으로 절단되고, 탈세포화된다. 이어서, 생성된 무세포 ECM 스캐폴드를 일차 내피 세포, 섬유아세포, 및 폐포 상피 유형 2 세포(AEC2s)로 재시딩한다. AEC2s는 무혈청, 화학적으로 정의된 성장 배지로 적어도 7일 동안 ELT 배양물에서 유지될 수 있다. 조직 준비 및 배양 과정 전반에 걸쳐, 슬라이스는 카세트 시스템으로 클리핑되어 여러 ELT의 처리 및 표준화된 세포 시딩을 병렬로 용이하게 합니다. 이 ELT는 AEC2 및 그 틈새 시장을 조절하는 생화학 적 신호뿐만 아니라 폐포 내의 세포 – 세포 및 세포 – 매트릭스 상호 작용에 대한 조사를 용이하게해야하는 유기형 배양 플랫폼을 나타냅니다.
폐포는 원위 폐의 기능 단위로, 폐포 상피 유형 1 세포 (AEC1s) 및 유형 2 세포 (AEC2s)에 의해 줄 지어있는 가스 교환 공극의 메쉬 워크를 포함한다. 상피의 기저에는 모세혈관의 조밀한 네트워크뿐만 아니라 중간엽을 지지하며, 이 섬세한 공기 주머니1에 강도와 유연성을 모두 제공하는 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드에 의해 엉덩이가 됩니다. 폐포는 또한 특발성 폐 섬유증2, 급성 호흡 곤란 증후군3 및 심각한 코로나 바이러스 질병 -19 (COVID-19)4를 포함한 수많은 폐 병리에서 부상 부위입니다. 지난 십 년 동안의 연구가 폐 상피 내에서 현저한 가소성을 밝혀냈지만, 일부 환경에서 원위 폐 복구를 가능하게 하는 메커니즘 – 그리고 다른 환경에서의 복구를 배제하는 메커니즘 – 은 여전히 강렬한 조사의 영역으로 남아 있습니다5. 폐포를 모델링하기 위해 개선 된 시험관 내 플랫폼의 개발은 폐포 생물학, 재생 및 치료제에 대한 연구를 촉진 할 것입니다.
AEC2s는 자가-갱신되고 AEC1s로 분화되며, 따라서 원위 폐6,7,8의 일차 줄기 세포로 간주된다. 그러나, 이들 세포는 표현형9의 손실 없이 일차 AEC2s를 배양하는 것과 관련된 어려움을 감안할 때 시험관내 연구에 특별한 도전을 제기한다. 종래의 2차원(2D) 배양에서, AEC2는 AEC1-유사 세포(10)의 일부 특징을 평탄화하고 채택한다. 대조적으로, 가장 일반적으로 오가노이드인 3D 배양 전략은 일차 AEC2s6,11,12에서 분화된 기능의 유지를 지원하고 다능성 줄기 세포(PSC) 유래 AEC2s13,14의 장기 배양을 허용한다. 오가노이드는 원위 폐 발달 15, 바이러스 감염11,15 및 AEC2 관련 유전 질환13,16,17을 모델링하는 데 사용되어 AEC2 생물학 및 재생에 대한 중요한 통찰력을 가능하게합니다. 그러나, 이들 배양 모델은 전형적으로 단지 하나 또는 두 개의 세포 계보를 포함하고, 천연 폐포의 아키텍처 또는 ECM 기질 중 어느 하나를 재검토하지 못하는 겔형 매트릭스에 세포를 내장한다.
ECM은 분자적, 지형적, 기계적 단서를 통한 세포 표현형 및 행동의 중요한 조절자입니다. 줄기 세포 운명을 조절하는 조직 특이적 틈새 시장의 핵심 구성 요소를 포함; 국 부적으로 분비된 성장 인자18,19,20,21의 이용가능성을 조절하는 저수지 역할을 한다. 따라서 천연 ECM 상에서 세포를 배양하는 것은 생체내 조직의 생물학을 모델링하기 위해 시험관내 시스템의 예측 능력을 증가시킬 수 있다. 탈세포화, 세제, 효소 또는 물리적 또는 기타 방법을 통해 조직에서 세포 물질을 제거하는 과정으로,22,23을 신중하게 수행 할 때 천연 기관의 ECM 스캐 폴딩을 상당 부분 보존 할 수 있습니다. 이러한 스캐폴드는 3D 생체모방 배양을 위해 세포로 재채워질 수 있다. 그러나, 탈세포화 스캐폴드는 조직 공학 응용에 널리 사용되지만, 일상적인 세포 배양을 위한 이들의 사용은 제한되었다. 몇몇 이전의 연구들은 폐 절편 또는 작은 폐 조직 세그먼트의 탈세포화 및 재세포화를 보고하였다. 개념 증명 연구 24,25,26 외에도, 재채워진 폐 조각은 섬유아세포-매트릭스 접착력 27,28을 연구하고 섬유아세포 표현형 27,29에 대한 병든 폐 매트릭스의 효과를 조사하기 위해 사용되었다. 정밀 절단 조직 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 향상된 기술을 통해 탈세포 폐 조각은 폐포, 기도 및 혈관 하부 구조를 보존하면서 세포를 배양하는 편리하고 작은 규모의 플랫폼을 제공 할 수 있습니다. 여러 세포 유형을 통합하면 생리적으로 관련된 3D 환경 내에서 세포 – 세포 상호 작용에 대한 연구가 가능합니다. 그러나, 배양 과정 전반에 걸쳐 조직의 취급을 용이하게 하고, 알려진 수의 세포를 갖는 조직의 제어되고 재현가능한 시딩을 보장하기 위해서는 개선된 전략이 필요하다.
여기에서는 탈세포화 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)을 일차 내피 세포, AEC2s 및 섬유 아세포로 재채움으로써 조작 폐 조직 (ELT)을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 앞서 기술한 조작된 심장 조직 시스템(30) 및 전체 폐 탈세포화-재세포화 전략(22,31)의 적응에서, 우리는 쥐 폐로부터 PCLS를 절단하고 절편을 재사용 가능한 조직 배양 카세트로 클리핑하여 하류 조작을 단순화하고 표준화하는 절차를 기술한다. 잘린 슬라이스는 탈세포화되어 무세포 ECM 스캐폴드를 형성하며, 이는 맞춤형 시딩 욕조에 다시 채워집니다. 폐 슬라이스 스캐폴드는 중요한 ECM 구성 요소 및 아키텍처를 보존하고 최소 7일 동안 다중 계통 폐포 유사 구조 내에서 AEC2의 성장을 지원합니다. ELT는 AEC2 및 폐포에 대한 기본 생물학적 연구를 촉진하면서 폐 조직 공학 전략의 개발을 지원해야하는 생리 학적 관련 3D 매트릭스 내에서 새로운 폐포 공동 배양 시스템을 나타냅니다.
이 논문은 다계보 폐포와 같은 구조를 포함하는 시험관 내에서 조작 된 폐 조직을 생성하기위한 플랫폼으로 탈세포화 된 정밀 절단 폐 슬라이스의 사용을 설명합니다. 전체 폐 공학22,31을 위해 고충실도 무세포 ECM 폐 스캐폴드를 재채우기 위해 이전에 개발한 전략과 소규모 엔지니어링 심장 조직(30)을 배양하기 위한 강력한 시스템을 결합함으로써, 이 프로토콜은 반복 가능하고 중간 처리량 방식으로 생리학적으로 관련된 폐 ECM을 조직 배양 기질로 사용할 수 있게 합니다.
여기에 제시된 방법은 쉽게 얻을 수 있는 래트 폐로부터의 ELT 스캐폴드 제제를 상세히 설명하며, 아가로스 인플레이션을 위한 온전한 기도에 직접 접근하여 엔블록 으로 추출될 수 있으며, 마우스 폐보다 크기가 더 크다. 그러나, 아가로오스로 팽창될 수 있고 적어도 9mm 길이의 슬라이스를 수득할 수 있는 임의의 폐 조직이 이 시스템 내에서 사용될 수 있다. 조직 공급원에 관계없이, 아가로스를 사용한 폐 조직의 균일한 팽창은 하류 조직 슬라이싱, 클리핑 및 조직 처리의 성공을 보장하기 위한 가장 중요한 단계입니다. 과소 팽창 된 폐 조직은 깨끗하게 슬라이스되지 않는 경향이 있으며, 지나치게 팽창 된 조직은 클리핑 중에 찢어질 수 있습니다. 아가로스 겔화 후, 적절하게 팽창된 조직 영역은 단단하지만 포셉으로 부드럽게 눌렀을 때 약간의 부여를 제공한다. 손상되지 않은 쥐 폐의 경우, 우리는 추출 된 폐를 공기로 여러 번 미리 팽창시킨 다음 추출 후 가능한 한 빨리 아가로스 인플레이션을 일으켜 최상의 슬라이싱 결과와 결과 조직 스캐폴드의 최상의 품질을 초래한다는 것을 발견했습니다. 적절한 양의 아가로스는 경험적으로 최적화되어야합니다. 래트 폐의 경우 폐를 총 폐 용량으로 팽창시키는 데 필요한 부피는 약 30 mL/kg 동물 질량이다(예를 들어, 350 g 래트의 폐에 대해 10.5 mL 아가로스). 기도 접근이 덜 간단한 더 큰 절제된 폐 조직(예: 인간 기증자로부터의 조직)의 경우, 기관지(32)를 통해 조직을 팽창시키기 위해 몇 가지 추가적인 트러블슈팅이 필요할 수 있다. 후속 폐 슬라이싱 동안, 플런저 상의 조직의 선택 및 배향은 1) 슬라이스가 조직 배양 카세트로 클리핑될 수 있는 조직 스트립을 생성하기에 충분히 크도록 보장하고, 2) 큰 기도 또는 혈관을 제외한 실질(alveolar) 조직 영역을 최대화하는 또 다른 중요한 단계이다.
PCLS를 조직 배양 카세트로 클리핑하는 것은 처음에는 어려운 단계가 될 수 있지만 카세트는 탈세포화 및 시딩 중에 조직 취급을 크게 단순화합니다. 발생할 수 있는 두 가지 잠재적인 문제는 조직 찢어짐(클리핑 과정 중 또는 탈세포화 동안) 또는 불량한 다운스트림 시딩을 초래하는 클립에서의 조직 위치(예를 들어, 시딩 없음, 또는 단지 끝에서 시딩)이다. 찢어짐은 아가로오스 과팽창, 탭 삽입 중 조직의 과도한 스트레칭, 또는 탭을 삽입할 때 적절한 조직 그립을 제공하기 위해 너무 적은 오버행을 남기는 결과일 수 있습니다. 한 클립 끝에서 찢어지는 조각은 성공적으로 시딩될 수 있지만, 조직이 평평하지 않기 때문에 배양 중에 현미경으로 시각화하기가 어렵습니다. 불량한 조직 시딩( 그림 6C에서와 같은)은 슬라이스가 두 클립 사이에 평평하게 놓여 있지 않은 결과일 가능성이 높으며, 따라서 거꾸로 뒤집을 때 시딩 배쓰의 베이스와 잘 접촉하지 못하게 된다. 또 다른 가능한 원인은 파종 목욕의 바닥에있는 카세트의 부적절한 좌석입니다. 클리핑 측면에서 두 번째 클립을 평평하게 놓을 때 조직에 약간 더 많은 장력을 가하여 평평하게 눕히도록 하십시오. 일부 조각에는 약간의 오목함이 있습니다. 이 경우 볼록한 면을 위로 향하게 하여 슬라이스를 클립합니다. 연습을 통해 우리는 일반적으로 슬라이스의 2 % 미만으로 시드가 실패하는 것을 경험합니다.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 ELT 준비를 위한 초기 재료를 생성하기 위해 레이저 커터 및 3D 프린터와 같은 일부 특수 장비에 대한 요구 사항입니다. 그러나 조직 배양 카세트와 시딩 욕조가 만들어지면 추가 특수 재료가 필요하지 않습니다. ELT 스캐폴드 제제의 폐 슬라이싱 및 탈세포화 단계는 적당히 시간이 소요되고; 그러나, 이들 단계들은 사전에 수행될 수 있거나, 또는 동시에 다수의 실험을 준비하기에 충분한 숫자로 수행될 수 있다. 많은 PCLS (실질 영역에 최적화하는 경우 >100)는 단일 폐에서 절단하고 나중에 사용하기 위해 스냅 냉동 할 수 있습니다. 단일 동결-해동 사이클이 ECM46에 경미한 초구조적 손상을 야기할 수 있지만, 심지어 다수의 동결-해동 사이클조차도 ECM 23,47에서 상당한 손실을 야기하지 않는 것으로 입증되었다. PCLS는 또한 실험 전에 클리핑되고 탈세포화될 수 있으며, 한 달 이내에 사용될 수 있다. (주목할 만하게, 기술된 탈세포화 프로토콜은 대략 6시간 내에 달성될 수 있으며, 이는 하루 이상의27,28을 필요로 하는 앞서 기술된 방법들에 비해 상당한 이점을 나타낸다.) 일단 스캐폴드가 준비되면, 세포 시딩 과정은 간단하고 빠르며, ELTs의 배양은 특별한 기술을 필요로 하지 않는다.
기술된 ELT 방법의 주의사항은 영역-특이적 시딩의 결여, 즉, AEC2s를 폐포 공간으로의 특이적으로 전달하거나, 혈관 공간으로의 내피 세포로의 특이적인 전달이다. 그럼에도 불구하고, 세포는 단순히 조직 스캐폴드의 상부에 시딩되지만, 재세포화의 패턴은 무작위적이지 않으며, 상피 고리를 포함한 폐포 유사 조직의 일부 유사성이 있다. 우리는 세포 – 세포 상호 작용뿐만 아니라 ECM 조성 및 기하학20,21의 국부적 차이가 관찰 된 재세포 화 패턴에 기여할 가능성이 있다고 의심합니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해, 섬유아세포가 탈세포화된 폐 절편에 비특이적으로 시딩된 이전에 발표된 연구에서, 조직 재집단 및 관련 세포 표현형의 패턴이 현미경적 조직 영역 및 ECM 스캐폴드 공급원(예를 들어, 건강한 대 병든 것)에 의해 유의하게 변화한다는 것을 입증하였다27. 섬유아세포는 또한 간질로 침입하는 것으로 관찰되었다 – 그들이 토착 폐 조직에 거주하는 위치 1,27. 진정한 영역 특이적 방식으로 폐 조각에서 세포를 배양하는 것을 상상할 수있는 주요 대안 방법은 기도31,48 및 혈관 구획 49,50을 통해 손상되지 않은 탈세포화 된 폐를 시딩 한 다음 재세포 화 된 조직을 슬라이싱하는 것을 수반합니다. 그러나, 이러한 대안 1)은 상당히 더 많은 비용-, 시간-, 및 자원-집약적이다; 2) 처리량이 낮다. 3) 동물의 수를 늘려야합니다. 4) 전체 폐 배양의 도전 및 시드 된 폐의 후속 슬라이싱으로 인한 오염 위험 증가와 관련이 있습니다. 네이티브 세포 조직의 모든 측면을 되풀이하지는 않지만, ELT 플랫폼은 생리학적으로 관련된 ECM 기질 상에서 폐 세포 배양을 가능하게 하며, 이는 더 많은 실험실에서 접근할 수 있는 방식으로 가능하다.
ELT 시스템의 유연성은 이러한 플랫폼의 주요 이점이며, 관심있는 임의의 수의 조직 스캐폴드, 세포 또는 배양 배지와 함께 소규모 폐 조직 배양을 허용해야 한다. 병든 조직 또는 손상 모델로부터 유래된 스캐폴드의 사용은 질병-변경된 ECM 27,29,51의 설정에서 세포-세포 또는 세포-매트릭스 상호작용의 연구를 허용할 수 있다. 그러나, 탈세포화 프로토콜은 종(52) 사이의 매트릭스 차이를 설명하기 위해 적응될 필요가 있을 수 있다는 점에 유의한다. 기술된 시딩 전략은 임의의 세포 유형에 사용될 수 있고, 배양 타임라인은 연구자의 요구에 적합하도록 적응된다. 시작점으로, 스캐폴드 당 1 x 106 세포는 배양 후 7 일 이내에 높은 세포 조직을 산출해야하는 반면, 1 x 105 총 세포는 불량한 세포성을 초래합니다. 타임라인의 임의의 적응에서, 조직 배양 카세트는 마지막 조직 시딩 후 24시간 후에 시딩 배쓰로부터 제거되어야 한다. 여기에서는 폐 폐포의 세포 복잡성 중 일부를 모델링하는 것을 목표로 적어도 7 일 동안 폐포 유사 구조에서 잘 분화 된 신생아 AEC2s의 유지를 지원하는 삼중 배양 재세포화 전략을 설명합니다. 우리의 결과는 또한 ELT 내에서 섬유아세포와 내피 세포의 성공적인 생착을 입증하며, 배양 기질의 광범위한 적용 가능성과 공동 배양 연구에 대한 적합성을 강조합니다. ELTs에서 성체 세포를 시딩하는 것은 더 정동작 폐포 구조의 모델링을 용이하게 할 수 있는 반면, 유전자 변형을 갖는 것을 포함하는 인간 PSC 유래 AEC2s를 시딩하는 것은 인간 질병13,53의 번역 연구를 용이하게 할 수 있다. 일반적으로, ELT 플랫폼에 의해 활성화된 상향식 접근법은 AEC2 증식 또는 분화 상태와 같은 관심있는 판독에 대한 특정 세포 유형의 기여를 조사할 기회를 제공한다.
요약하면, 이 프로토콜은 무세포 ECM 폐 슬라이스 스캐폴드 내의 AEC2s, 섬유아세포 및 내피 세포의 공동 배양 연구를 위한 조작된 폐 조직을 생성하기 위한 견고한 시스템을 개략적으로 설명합니다. ELT는 일차 AEC2s에 대한 새로운 3D 배양 전략을 나타내며, 현재까지 잘 분화 된 표현형 6,11,12를 유지하기 위해 덜 생리학적인 겔형 매트릭스에 의존해 왔다. 현재의 플랫폼은 탈세포화 된 폐 절편24,25,26,27,28,29의 재 집단에 대한 이전 연구를 기반으로하지만 몇 가지 이점을 제공합니다 : 1) 탈세포화, 시딩 및 배양 중에 ELT 처리를 용이하게하는 조직 배양 카세트 시스템; 2) 각 슬라이스 스캐폴드 상에 공지된 수의 세포를 정확하게 시드하기 위한 맞춤형 시딩 배쓰; 3) 상피, 중간엽 및 내피 세포로 폐포 조직 재집단을 가능하게하는 삼중 배양 재 시딩 전략. 따라서, ELT는 천연 폐포 및 AEC2 줄기 세포 틈새 시장의 세포 및 기질 복잡성을 포착하는 재현 가능한 시험관내 모델을 만들기 위한 중요한 진전을 나타낸다.
The authors have nothing to disclose.
저자들은 로렌조 세와난과 호르헤 누네즈가 이 프로토콜에 사용된 조직 배양 카세트 디자인을 개발하고, 비브라토메를 사용하기 위한 카민스키 실험실, 폐 슬라이싱에 도움을 준 마우리치오 치오키올리와 제시카 누스, 초기 파일럿 실험에 도움을 준 앨리 라로코, 프로토콜을 주의 깊게 읽은 홍키안에게 감사를 표하고 싶다. 이 연구는 NIH 보조금 F30HL143880 (K.L.L.), 의료 과학자 교육 프로그램 교육 보조금 T32GM136651 (K.L.L.), U01HL145567 (L.E.N.)에 의해 지원되었습니다. Humacyte Inc. (L.E.N.)의 무제한 연구 선물에 의해.
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |