פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות בקנה מידה קטן הניתנות לשחזור, על-ידי אכלוס מחדש של פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת עם תאי אפיתל מסוג 2, פיברובלסטים ותאי אנדותל.
יש צורך במודלים משופרים של ריאה תלת-ממדית (תלת-ממדית) שמשחזרים את המורכבות האדריכלית והתאית של ה-alveolus ex vivo המקורי של הריאה. מודלים אורגנואידיים שפותחו לאחרונה אפשרו את ההרחבה והמחקר של אבות אפיתל הריאה במבחנה, אך פלטפורמות אלה מסתמכות בדרך כלל על מטריצה ו/או סרום שמקורם בגידולי עכברים, ומשלבות שושלות תאיות אחת או שתיים בלבד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת רקמות ריאה מהונדסות (ELTs) המבוסס על רסלאריזציה מרובת שושלת של פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) שעברו דה-תאיזציה. ELTs מכילים מבנים דמויי נאדיות הכוללים אפיתל נאדי, מזנכים ואנדותל, בתוך מצע מטריצה חוץ-תאית (ECM) הדומה מאוד לזה של הריאה המקומית. כדי ליצור את הרקמות, ריאות החולדה מנופחות באגרוז, נחתכות לפרוסות בעובי 450 מיקרומטר, נחתכות לרצועות ועוברות דה-תאיזציה. פיגומי ה-ECM התאיים שנוצרים כתוצאה מכך נזרעים מחדש עם תאי אנדותל ראשוניים, פיברובלסטים ותאי אפיתל מסוג 2 (AEC2s). AEC2s יכולים להישמר בתרבית ELT למשך 7 ימים לפחות עם מדיום גדילה ללא סרום ומוגדר כימית. לאורך כל תהליך הכנת הרקמות והתרבית, הפרוסות נחתכות למערכת קלטות המאפשרת טיפול וזריעת תאים מתוקננת של מספר ELTs במקביל. ELTs אלה מייצגים פלטפורמת תרבית אורגנוטיפית שאמורה להקל על חקירות של אינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים בתוך הנאדיות, כמו גם אותות ביוכימיים המווסתים את AEC2s ואת הנישה שלהם.
נאדיות הן היחידות התפקודיות של הריאה הדיסטלית, המורכבות מעבודת רשת של מרחבי אוויר מחליפי גזים המרופדים בתאי אפיתל מסוג 1 (AEC1s) ותאים מסוג 2 (AEC2s). בבסיס האפיתל עומדת רשת צפופה של נימים, כמו גם מזנכים תומכים, כולם מחוזקים על ידי פיגום מטריצה חוץ-תאית (ECM) המספק הן חוזק והן גמישות לשקי האוויר העדינים האלה1. הנאדיות הן גם אתר הפגיעה בפתולוגיות ריאה רבות, כולל פיברוזיס ריאתי אידיופטי2, תסמונת מצוקה נשימתית חריפה3 ומחלת קורונה קשה -19 (COVID-19)4. למרות שהעבודה בעשור האחרון חשפה פלסטיות יוצאת דופן באפיתל הריאה, המנגנונים המאפשרים תיקון ריאה דיסטלי במסגרות מסוימות – ומונעים תיקון באחרות – נותרו תחום של חקירה אינטנסיבית5. פיתוח פלטפורמות משופרות במבחנה כדי לדגום את הנאדיות יקל על מחקרים על ביולוגיה של נאדיות, התחדשות וטיפולים.
AEC2s מחדשים את עצמם ומבדילים אותם ל-AEC1s, ולכן נחשבים לתאי הגזע העיקריים של הריאה הדיסטלית 6,7,8. עם זאת, תאים אלה מהווים אתגר מיוחד למחקר במבחנה בהתחשב בקשיים הקשורים לגידול AEC2 ראשוניים ללא אובדן של פנוטיפ9. בתרבית דו-ממדית (2D) קונבנציונלית, AEC2s משטחים ומאמצים תכונות מסוימות של תאים דמויי AEC110. לעומת זאת, אסטרטגיות תרביות תלת-ממדיות, לרוב אורגנואידים, תומכות בשמירה על תכונות מובחנות ב-AEC2sראשוניים 6,11,12 ומאפשרות תרבית ארוכת טווח של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) שמקורם ב-AEC2s13,14. אורגנואידים שימשו למדל התפתחות ריאות דיסטלית15, זיהום ויראלי11,15, ומחלות גנטיות הקשורות ל-AEC2 13,16,17, מה שמאפשר תובנות חשובות על ביולוגיה והתחדשות של AEC2. עם זאת, מודלים אלה של תרביות כוללים בדרך כלל שושלות תאיות אחת או שתיים בלבד, ומטביעים את התאים במטריצות מסוג ג’ל שאינן מצליחות לשחזר את הארכיטקטורה או את מצע ה-ECM של נאדיות הריאה הטבעית.
ה-ECM הוא מווסת קריטי של פנוטיפ והתנהגות התא באמצעות רמזים מולקולריים, טופולוגיים ומכניים; מהווה מרכיב מרכזי בגומחות ספציפיות לרקמות המווסתות את גורל תאי הגזע; ומשמש כמאגר המווסת את הזמינות של גורמי גדילה המופרשים באופן מקומי 18,19,20,21. לפיכך, גידול תאים ב-ECM מקומי עשוי להגביר את יכולת הניבוי של מערכות in vitro כדי למדל את הביולוגיה של רקמות in vivo. דה-תאיזציה, תהליך המסיר חומר תאי מרקמות באמצעות דטרגנטים, אנזימים או שיטות פיזיות או אחרות, יכול לשמר במידה רבה את פיגומי ה-ECM של איבר מקומי, כאשר הם מבוצעים בקפידה22,23. ניתן לאכלס מחדש פיגומים כאלה בתאים לתרבית ביומימטית תלת-ממדית. עם זאת, בעוד שפיגומים שעברו דה-תאיזציה נמצאים בשימוש נרחב ליישומים של הנדסת רקמות, השימוש בהם לתרבית תאים שגרתית היה מוגבל. מספר מחקרים קודמים דיווחו על דה-תאיזציה ורה-סלולריזציה של פרוסות ריאה או מקטעי רקמת ריאה קטנים. בנוסף למחקרי הוכחת היתכנות 24,25,26, נעשה שימוש בפרוסות ריאה מאוכלסות מחדש כדי לחקור הידבקות של מטריצת פיברובלסט27,28 ולחקור את ההשפעה של מטריצות ריאה חולות על פנוטיפ פיברובלסט27,29. עם טכנולוגיות משופרות הזמינות ליצירת פרוסות רקמות חתוכות באופן מדויק, פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה יכולות להציע פלטפורמה נוחה וקטנה שבאמצעותה ניתן לתרבת תאים, תוך שמירה על תת-מבנים של נאדיות, דרכי הנשימה וכלי הדם. שילוב של סוגי תאים מרובים יאפשר לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים בתוך סביבה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, יש צורך באסטרטגיות משופרות כדי להקל על הטיפול ברקמות לאורך כל תהליך התרבית, ולהבטיח זריעה מבוקרת וניתנת לשחזור של רקמות עם מספר ידוע של תאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת רקמות ריאה מהונדסות (ELTs) על ידי ריפוד מחדש של פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) עם תאי אנדותל ראשוניים, AEC2s ופיברובלסטים. בהסתגלות של מערכת רקמת הלב המהונדסת שלנושתוארה בעבר 30 ואסטרטגיות רה-תאיזציה של ריאות שלמות22,31, אנו מתארים פרוצדורות לחיתוך PCLS מריאות חולדות ולקיצוץ הפרוסות לקלטות תרביות רקמה רב-פעמיות המפשטות ומתוקנות מניפולציות במורד הזרם. פרוסות חתוכות עוברות דה-תאיזציה ליצירת פיגומי ECM תאיים, המאוכלסים מחדש באמבטיות זריעה מותאמות אישית. פיגומי פרוסות ריאה משמרים רכיבים וארכיטקטורה קריטיים של ECM, ותומכים בצמיחה של AEC2s בתוך מבנים דמויי נאדיות מרובי שושלת למשך 7 ימים לפחות. ELTs מייצגים מערכת חדשה של תרבית משותפת אלוואולרית בתוך מטריצה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית, שאמורה לתמוך בפיתוח אסטרטגיות של הנדסת רקמות ריאה, תוך הקלה על מחקרים ביולוגיים בסיסיים של AEC2s וה-alveolus.
מאמר זה מתאר את השימוש בפרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת כפלטפורמה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות במבחנה, המכילות מבנים דמויי אלוואולר רב-שושלתיים. על ידי שילוב אסטרטגיות שפיתחנו בעבר כדי לאכלס מחדש פיגומי ריאה ECM תאיים בנאמנות גבוהה עבור הנדסת ריאות שלמה22,31, עם המערכת החזקה שלנו לעיבוד מחדש של רקמות לב מהונדסות בקנה מידה קטן30, פרוטוקול זה מאפשר שימוש ב- ECM של ריאה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמצע תרבית רקמה, באופן הניתן לחזרה ותפוקה בינונית.
השיטות המוצגות כאן מפרטות את הכנת פיגומי ELT מריאות חולדה, הניתנות להשגה בקלות, ניתן לחלץ אותן בגוש עם גישה ישירה לדרכי אוויר שלמות לצורך אינפלציית אגרוז, והן בגודל גדול יותר מריאת עכבר. עם זאת, כל רקמת ריאה שניתן לנפח עם אגרוז ולהניב פרוסות באורך של לפחות 9 מ”מ עשויה לשמש במערכת זו. ללא קשר למקור הרקמה, אינפלציה אחידה של רקמת הריאה עם אגרוז היא הצעד הקריטי ביותר להבטחת ההצלחה של חיתוך, גזירה וטיפול ברקמות במורד הזרם. רקמת ריאה מנופחת בתת-זווית נוטה שלא להיפרס בצורה נקייה, בעוד שרקמה מנופחת יתר על המידה עלולה להיקרע במהלך החיתוך. לאחר ג’לציה של אגרוז, אזורי רקמות מנופחים כראוי הם מוצקים אך מספקים מעט לתת כאשר לוחצים בעדינות עם מלקחיים. עבור ריאות חולדה שלמות, מצאנו כי ניפוח מראש של הריאות המופקות עם אוויר מספר פעמים, ואחריו אינפלציית אגרוז בהקדם האפשרי לאחר המיצוי, מביא לתוצאות החיתוך הטובות ביותר ולאיכות הטובה ביותר של פיגומי הרקמות המתקבלים. הנפח המתאים של אגרוז צריך להיות מותאם אמפירית; עבור ריאה של חולדה, הנפח הנדרש כדי לנפח את הריאה לקיבולת הריאות הכוללת הוא כ-30 מ”ל/ק”ג מסת בעלי חיים (למשל, 10.5 מ”ל אגרוז לריאות מחולדה של 350 גרם). עבור רקמות ריאה גדולות יותר שנכרתו עם גישה פחות פשוטה לדרכי הנשימה (כגון אלה של תורמים אנושיים), ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות נוסף כדי לנפח את הרקמה באמצעות ברונכוס32. במהלך חיתוך הריאה שלאחר מכן, הבחירה והכיוון של הרקמה על הבוכנה היא צעד חשוב נוסף 1) להבטיח כי הפרוסות גדולות מספיק כדי ליצור רצועות רקמה שניתן לחתוך לתוך קלטות תרבית רקמה 2) למקסם את שטח הרקמה parenchymal (alveolar), למעט דרכי הנשימה הגדולות או כלי הדם.
חיתוך ה- PCLS לקלטות תרבית רקמה יכול להיות צעד מאתגר בתחילה, אך הקלטות מפשטות מאוד את הטיפול ברקמות במהלך דה-תאיזציה וזריעה. שתי בעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר הן קריעת רקמות (במהלך תהליך החיתוך, או במהלך הדה-תאיזציה), או מיקום רקמות בקליפסים שגורם לזריעה לקויה במורד הזרם (למשל, ללא זריעה, או זריעה רק בקצוות). קריעה עשויה להיות תוצאה של אינפלציית יתר של אגרוז, מתיחת יתר של הרקמה במהלך החדרת לשונית, או השארת מעט מדי תקרה כדי לספק אחיזת רקמה מספקת בעת החדרת הכרטיסיות. שימו לב שפרוסות שנקרעות בקצה קליפ אחד עשויות להיזרק בהצלחה, אולם קשה לדמיין אותן מתחת למיקרוסקופ במהלך התרבית מכיוון שהרקמה אינה שטוחה. זריעת רקמות לקויה (כמו זו שבאיור 6C) היא ככל הנראה תוצאה של העובדה שהפרוסה לא שכבה שטוחה בין שני הקליפים, ובכך יוצרת מגע לקוי עם בסיס אמבט הזריעה היטב כשהיא הפוכה. סיבה אפשרית נוספת היא ישיבה לא נכונה של הקלטת בתחתית אמבט הזריעה היטב. מבחינת גזירה, יש למרוח מעט יותר מתח ברקמה בעת הנחת הקליפ השני כדי לעזור לו לשכב שטוח. לחלק מהפרוסות יש קעורה קלה; במקרים אלה חותכים את הפרוסה עם הצד הקמור למעלה. עם התרגול, אנו בדרך כלל חווים זריעה כושלת עם פחות מ-2% מהפרוסות.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא הדרישה עבור כמה ציוד מיוחד – חותך לייזר ומדפסת 3D – כדי ליצור את החומרים הראשוניים להכנת ELT. עם זאת, לאחר שנוצרות קלטות תרביות הרקמה ואמבטיות הזריעה, אין צורך בחומרים מיוחדים נוספים. שלבי החיתוך והדה-תאיזציה של הריאות בהכנת פיגומי ELT גוזלים זמן רב במידה בינונית; עם זאת, צעדים אלה עשויים להתבצע מראש, או במספרים המספיקים כדי להתכונן לניסויים מרובים בו זמנית. PCLS רבים (>100 אם מייעלים אותם לאזורים פרנכימליים) ניתנים לחתוך מריאה אחת ולהקפיא אותם לשימוש מאוחר יותר. בעוד שמחזור הפשרה יחיד של הקפאה עלול לגרום לנזק אולטרה-סטרוקטורלי קל ל-ECM46, אפילו מחזורי הפשרה מרובים של הקפאה הוכחו כלא גורמים לאובדן משמעותי ב-ECM 23,47. ניתן גם לחתוך PCLS ולטהר אותו לפני ניסוי, לשימוש תוך חודש. (יש לציין כי ניתן לבצע את פרוטוקול הדה-תאיזציה המתואר תוך כ-6 שעות, מה שמייצג יתרון משמעותי על פני שיטות שתוארו קודם לכן הדורשות יום או יותרשל 27,28.) לאחר הכנת הפיגומים, תהליך זריעת התאים הוא פשוט ומהיר, ותרבית ה- ELTs אינה דורשת טכניקות מיוחדות.
אזהרה של שיטת ELT המתוארת היא היעדר זריעה ספציפית לאזור, כלומר מסירה של AEC2s במיוחד לחלל הנאדי, או תאי אנדותל במיוחד למרחב כלי הדם. אף על פי כן, אף על פי שהתאים פשוט נזרעים על גבי פיגומי הרקמה, תבנית ההסתגלות מחדש אינה אקראית, עם מראית עין מסוימת של ארגון דמוי נאדיות, כולל טבעות אפיתל. אנו חושדים כי אינטראקציות בין תאים לתאים, כמו גם הבדלים מקומיים בהרכב ה-ECM ובגאומטריה 20,21,ככל הנראה תורמים לדפוסי הרית-התא שנצפו. כדי לתמוך בהשערה זו, מחקר שפורסם בעבר, שבו פיברובלסטים נזרעו באופן לא ספציפי על פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה, הראה כי הדפוס של ריפוד מחדש של רקמות ופנוטיפים תאיים נלווים השתנו באופן משמעותי לפי אזור רקמה מיקרוסקופית ומקור פיגום ECM (למשל, בריא לעומת חולה)27. פיברובלסטים נצפו גם פולשים לתוך האינטרסטיציום – המיקום שבו הם שוכנים ברקמת ריאה מקומית 1,27. השיטה החלופית העיקרית שאנו יכולים לדמיין כדי לתרבת תאים על פרוסות ריאה באופן ספציפי באמת לאזור, תהיה כרוכה בזריעת ריאות נטולות תאים שלמים דרך דרכי הנשימה31,48 ותאי כלי הדם49,50, ולאחר מכן חיתוך הרקמה התאית מחדש. עם זאת, חלופה זו 1) היא הרבה יותר עלות, זמן ומשאבים עתירי משאבים; 2) הוא תפוקה נמוכה יותר; 3) דורש מספר גדל והולך של בעלי חיים; ו-4) קשורה לסיכון מוגבר לזיהום עקב האתגרים של תרבית ריאות שלמה וחיתוך של הריאה הזורעת לאחר מכן. למרות שאינה מסכמת את כל ההיבטים של ארגון תאי מקומי, פלטפורמת ELT מאפשרת תרבית תאי ריאה על מצע ECM רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, באופן נגיש למעבדות רבות נוספות.
הגמישות של מערכת ELT היא יתרון גדול של פלטפורמה זו, ואמורה לאפשר תרבית רקמת ריאה בקנה מידה קטן עם כל מספר של פיגומי רקמות, תאים או מדיה תרבית מעניינת. השימוש בפיגומים שמקורם ברקמה חולה או ממודלים של פציעה עשוי לאפשר מחקר של אינטראקציות בין תאים לתאים או למטריצות תאים בסביבה של ECM 27,29,51 ששונה ממחלה. עם זאת, שים לב שייתכן שיהיה צורך להתאים את פרוטוקול הדה-תאיזציה כדי להסביר את הבדלי המטריצה בין מינים52. אסטרטגיית הזריעה המתוארת יכולה לשמש לכל סוג תא, וציר הזמן של התרבית מותאם כך שיתאים לצרכי החוקר. כנקודת מוצא, 1 x 106 תאים לכל פיגום אמורים להניב רקמה תאית גבוהה תוך 7 ימים מהתרבית, בעוד ש-1 x 105 תאים בסך הכל גורמים לתאים ירודים. בכל התאמה של ציר הזמן, יש להסיר את קלטות תרביות הרקמה מאמבט הזריעה 24 שעות לאחר זריעת הרקמה האחרונה. כאן, במטרה לדגום חלק מהמורכבות התאית של נאדיות הריאה, אנו מתארים אסטרטגיית רה-תאיזציה תלת-תרבית התומכת בתחזוקה של AEC2 יילודים מובחנים היטב במבנים דמויי נאדיות למשך 7 ימים לפחות. התוצאות שלנו גם מדגימות את ההשתלה המוצלחת של פיברובלסטים ותאי אנדותל בתוך ELTs, תוך שימת דגש על הישימות הרחבה של מצע התרבית והתאמתו למחקרי תרביות משותפות. זריעת תאים בוגרים ב-ELTs עשויה להקל על המידול של מבנים נאדיים שקטים יותר, בעוד שזריעה של תאי AEC2 שמקורם ב-PSC אנושי, כולל אלה עם שינויים גנטיים, עשויה להקל על מחקרים תרגומיים של מחלות אנושיות13,53. באופן כללי, הגישה מלמטה למעלה המאפשרת פלטפורמת ELT מציגה את ההזדמנות לחקור את התרומות של סוגי תאים מסוימים לקריאות מעניינות – כגון התפשטות AEC2 או מצב התמיינות.
לסיכום, פרוטוקול זה מתווה מערכת חזקה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות למחקרי תרבית משותפת של AEC2s, פיברובלסטים ותאי אנדותל בתוך פיגומי פרוסות ריאה ECM תאיים. ELTs מייצגים אסטרטגיית תרבות תלת-ממדית חדשנית עבור AEC2s ראשוניים, שעד כה הסתמכו בדרך כלל על מטריצות פחות פיזיולוגיות מסוג ג’ל כדי לשמור על פנוטיפ מובחן היטב 6,11,12. הפלטפורמה הנוכחית מתבססת על עבודות קודמות בתחום הריאה המחודשת של פרוסות 24,25,25,26,27,28,29, אך מציעה מספר יתרונות: 1) מערכת קלטות תרבית רקמה כדי להקל על טיפול ב-ELT במהלך דה-תאיזציה, זריעה ותרבית; 2) אמבט זריעה מותאם אישית כדי לזרוע במדויק מספר ידוע של תאים על כל פיגום פרוסה; ו-3) אסטרטגיית זריעה מחדש תלת-תרבית המאפשרת ריכון מחדש של רקמת הנאדיות עם תאי אפיתל, מזנכימל ואנדותל. לפיכך, ELTs מייצגים צעד חשוב קדימה לקראת יצירת מודלים ניתנים לשחזור במבחנה הלוכדים את המורכבות התאית והמצעית של הנאדיות המקומית ונישת תאי הגזע AEC2.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות ללורנצו סובאנן וחורחה נונז על עבודתם בפיתוח תכנון קלטת תרביות הרקמה המשמשות בפרוטוקול זה, למעבדת קמינסקי לשימוש בוויברטומה שלהם, למאוריציו צ’יוצ’יולי וג’סיקה נואוס על הסיוע בחיתוך ריאות, לאלי לרוקו על הסיוע בניסויי פיילוט ראשוניים, ולהונג צ’יאן על קריאה מדוקדקת של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH F30HL143880 (K.L.L.), מענק ההכשרה של תוכנית ההכשרה למדענים רפואיים T32GM136651 (K.L.L.), ו- U01HL145567 (L.E.N.); ועל ידי מתנת מחקר בלתי מוגבלת של Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |