Summary

Stereotaxische chirurgische benadering van micro-injecteren van de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg via de Cisterna Magna bij muizen

Published: January 21, 2022
doi:

Summary

Stereotaxische chirurgie om hersenlocaties bij muizen te targeten, omvat vaak toegang via de schedelbotten en wordt geleid door schedeloriëntatiepunten. Hier schetsen we een alternatieve stereotaxische benadering om de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg te richten via de cisterna magna die afhankelijk is van directe visualisatie van hersenstamoriëntatiepunten.

Abstract

Stereotaxische chirurgie om hersenlocaties bij muizen te targeten, wordt meestal geleid door schedeloriëntatiepunten. Toegang wordt vervolgens verkregen via braamgaten die door de schedel worden geboord. Deze standaardbenadering kan een uitdaging zijn voor doelen in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale navelstreng vanwege specifieke anatomische uitdagingen, omdat deze locaties ver verwijderd zijn van schedeloriëntatiepunten, wat leidt tot onnauwkeurigheid. Hier schetsen we een alternatieve stereotaxische benadering via de cisterna magna die is gebruikt om zich te richten op discrete gebieden van belang in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord. De cisterna magna strekt zich uit van het achterhoofdsbeen tot de atlas (d.w.z. het tweede wervelbeen), is gevuld met hersenvocht en wordt bedekt door dura mater. Deze benadering biedt een reproduceerbare toegangsweg tot geselecteerde structuren van het centrale zenuwstelsel (CZS) die anders moeilijk te bereiken zijn vanwege anatomische barrières. Bovendien maakt het directe visualisatie van hersenstamoriëntatiepunten in de nabijheid van de doellocaties mogelijk, waardoor de nauwkeurigheid toeneemt bij het leveren van kleine injectievolumes aan beperkte gebieden van belang in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord. Ten slotte biedt deze aanpak de mogelijkheid om het cerebellum te vermijden, wat belangrijk kan zijn voor motorische en sensomotorische studies.

Introduction

Standaard stereotaxische chirurgie om hersenplaatsen bij muizen te targeten1 omvat gewoonlijk fixatie van de schedel met behulp van een set oorstaven en een mondbalk. Coördinaten worden vervolgens geschat op basis van referentieatlassen 2,3 en schedeloriëntatoren, namelijk bregma (het punt waar de hechtingen van de frontale en pariëtale botten samenkomen) of lambda (het punt waar de hechtingen van de pariëtale en occipitale botten samenkomen; Figuur 1A,B). Via een braamgat in de schedel boven het geschatte doel kan vervolgens het doelgebied worden bereikt, hetzij voor levering van micro-injecties of instrumentatie met canules of optische vezels. Door variatie in de anatomie van deze hechtingen en fouten in de lokalisatie van bregma of lambda 4,5 varieert de positie van nulpunten ten opzichte van de hersenen van dier tot dier. Hoewel kleine fouten in de targeting, die het gevolg zijn van deze variabiliteit, geen probleem zijn voor grote of nabijgelegen doelen, is hun impact groter voor kleinere interessegebieden die ver verwijderd zijn van de nulpunten in de anteroposterior- of dorsoventrale vlakken en / of bij het bestuderen van dieren van verschillende grootte als gevolg van leeftijd, stam en / of geslacht. Er zijn verschillende extra uitdagingen die uniek zijn voor de medulla oblongata en het bovenste cervicale koord. Ten eerste zijn kleine veranderingen in anteroposteriorcoördinaten geassocieerd met significante veranderingen in dorsoventrale coördinaten ten opzichte van de dura, als gevolg van de positie en vorm van het cerebellum (figuur 1Bi)2,6,7. Ten tweede bevindt het bovenste cervicale koord zich niet in de schedel2. Ten derde maakt de schuine positie van het achterhoofdsbeen en de bovenliggende laag nekspieren2 de standaard stereotaxische benadering nog uitdagender voor structuren die zich in de buurt van de overgang tussen de hersenstam en het ruggenmerg bevinden (figuur 1Bi). Ten slotte zijn veel doelen van belang voor de caudale hersenstam en cervicale navelstreng klein2, waarvoor nauwkeurige en reproduceerbare injectiesnodig zijn 8,9.

Een alternatieve aanpak via de cisterna magna omzeilt deze problemen. De cisterna magna is een grote ruimte die zich uitstrekt van het achterhoofdsbeen tot de atlas (figuur 1A, d.w.z. het tweede wervelbeen)10. Het is gevuld met hersenvocht en bedekt met dura mater10. Deze ruimte tussen het achterhoofdsbeen en de atlas opent zich bij het anteroflexen van het hoofd. Het is toegankelijk door te navigeren tussen de bovenliggende gepaarde buiken van de longus capitis spier, waardoor het dorsale oppervlak van de caudale hersenstam wordt blootgesteld. Regio’s van belang kunnen dan worden gericht op basis van de oriëntatiepunten van deze regio’s zelf als ze zich in de buurt van het dorsale oppervlak bevinden; of door de obex te gebruiken, het punt waar het centrale kanaal uitkomt in de IV-ventrikel, als nulpunt voor coördinaten om diepere structuren te bereiken. Deze aanpak is met succes gebruikt bij verschillende soorten, waaronder de rat11, kat12, muis 8,9 en niet-menselijke primaat13 om zich te richten op de ventrale ademhalingsgroep, medullaire mediale reticulaire formatie, de kern van het solitaire kanaal, gebied postrema of hypoglossale kern. Deze aanpak wordt echter niet op grote schaal gebruikt, omdat het kennis van anatomie, een gespecialiseerde toolkit en meer geavanceerde chirurgische vaardigheden vereist in vergelijking met de standaard stereotaxische benadering.

Hier beschrijven we een stapsgewijze chirurgische aanpak om de hersenstam en het bovenste cervicale koord te bereiken via de cisterna magna, oriëntatiepunten te visualiseren, het nulpunt in te stellen (figuur 2) en doelcoördinaten te schatten en te optimaliseren voor stereotaxische afgifte van micro-injecties in de discrete hersenstam- en ruggenmerggebieden van belang (figuur 3). Vervolgens bespreken we de voor- en nadelen van deze aanpak.

Protocol

De auteur verklaart dat het protocol de richtlijnen volgt van het Institutional Animal Care and Use Committee in het Beth Israel Deaconess Medical Center. 1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten en stereotaxisch frame OPMERKING: De operatie wordt uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. De steriliteit wordt gehandhaafd met behulp van de steriele tiptechniek. Installeer de stereotaxische arm met een micropipette of spuit gevuld me…

Representative Results

De cisterna magna-benadering maakt het mogelijk om caudale hersenstam- en bovenste cervicale koordstructuren aan te pakken die anders moeilijk te bereiken zijn via standaard stereotaxische benaderingen of gevoelig zijn voor inconsistente targeting. De operatie om de cisterna magna te bereiken vereist incisies van de huid, een dunne laag trapeziusspier en opening van de dura mater en wordt daarom goed verdragen door muizen. Het is vooral efficiënt en minder invasief bij het richten op meerdere (longitudinaal ver…

Discussion

Standaard stereotaxische chirurgie vertrouwt vaak op schedeloriëntatiepunten om de coördinaten van doellocaties in het CZS1 te berekenen. Doellocaties zijn dan toegankelijk via braamgaten die door de schedel worden geboord1. Deze methode is niet ideaal voor de caudale hersenstam, omdat de doellocaties zich ver van de schedeloriëntatiepunten in de anteroposterior- en dorsoventrale vlakken2 bevinden en omdat de anatomie van de schedel en bo…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door R01 NS079623, P01 HL149630 en P01 HL095491.

Materials

Alcohol pad Med-Vet International SKU: MDS090735Z skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45 FST 11251-35 only to grab dura
Betadine pad Med-Vet International SKU:PVP-PAD skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate Thermo Fisher Scientific 488: C34775, 594: C22842 Fluorescent tracer
Clippers Wahl Model MC3, 28915-10 for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp Kopf 1770 to hold glass pipette
Flowmeter Gilmont instruments model # 65 MM to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene Thermo Fisher Scientific F13080 Fluorescent tracer
Heating pad Stoelting 53800M thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit Midmark Inc 93805107 92800131 chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe Exelint International 26028 to administer saline and analgesic
Isoflurane Med-Vet International SKU:RXISO-250 inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer Midmark Inc 91305430 apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2 FST 11223-20 only to clean dura
Medical air, compressed Linde UN 1002 used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR Zoo Pharm LLC Lot # MSR2-211201 analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube Globe Scientific Inc 51628 for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor Stoelting 0051625  adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats FST 91308-12 for suturing
Oxygen regulator Life Support Products S/N 909328, lot 092109 regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed Linde USP UN 1072 provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card not applicable not applicable any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar) World Precision Instruments (WPI) SYS-PV820 For precision solution injection
Saline, sterile Mountainside Medical Equipment H04888-10 to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3 FST 10003-12 to hold scalpel
Scissors, Wagner FST 14070-12 to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box FST 15002-08 scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator Kopf 1760-61 attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate Kopf 1730-B, 1711 frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators Puritan 25-806 10WC absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes Henry Schein 9004686 for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment Puralube P1490 ocular lubricant
Stimulator & Tubing Grass Medical Instruments S44 to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10 Med-Vet International SKU: 10SS for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe FST 11153-10 to hold skin
Surgical gloves Med-Vet International MSG2280Z for asceptic surgery
Surgical microscope Leica Model M320/ F12 for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene Oasis MV-8661 to close the skin
Tegaderm 3M 3M ID 70200749250 provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post Kopf 1725 attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats FST 18200-09, 13003-10 to separate muscles and provide surgical window

Referenzen

  1. JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
  2. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  3. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  4. Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
  5. Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
  6. Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
  7. Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
  8. Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
  9. Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
  10. Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
  11. Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
  12. Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
  13. Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
  14. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
  15. Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  16. Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
  17. Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Joshi, K., Kirby, A., Niu, J., VanderHorst, V. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (179), e63344, doi:10.3791/63344 (2022).

View Video