Summary

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Published: January 21, 2022
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Summary

Die stereotaktische Chirurgie zur Ausrichtung auf Gehirnstellen bei Mäusen beinhaltet häufig den Zugang durch die Schädelknochen und wird von Schädel-Landmarken geleitet. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz, um den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark über die Cisterna magna anzusprechen, der auf der direkten Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken beruht.

Abstract

Stereotaktische Chirurgie, um Gehirnstellen bei Mäusen anzuvisieren, wird häufig von Schädel-Landmarken geleitet. Der Zugang erfolgt dann über Gratlöcher, die durch den Schädel gebohrt werden. Dieser Standardansatz kann für Ziele im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang aufgrund spezifischer anatomischer Herausforderungen eine Herausforderung darstellen, da diese Stellen von Schädellandmarken entfernt sind, was zu Ungenauigkeiten führt. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz über die Cisterna magna, der verwendet wurde, um diskrete Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur anzusprechen. Die Cisterna magna erstreckt sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas (d.h. dem zweiten Wirbelknochen), ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und wird von Dura mater bedeckt. Dieser Ansatz bietet einen reproduzierbaren Zugang zu ausgewählten Strukturen des zentralen Nervensystems (ZNS), die aufgrund anatomischer Barrieren sonst schwer zu erreichen sind. Darüber hinaus ermöglicht es die direkte Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken in unmittelbarer Nähe zu den Zielstellen, wodurch die Genauigkeit bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur erhöht wird. Schließlich bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, das Kleinhirn zu vermeiden, was für motorische und sensomotorische Studien wichtig sein kann.

Introduction

Die stereotaktische Standardchirurgie zur gezielten Gehirnstelle beiMäusen 1 beinhaltet häufig die Fixierung des Schädels mit einem Satz Ohrstangen und einem Mundbalken. Die Koordinaten werden dann auf der Grundlage der Referenzatlanten2,3 und der Schädellandmarken geschätzt, nämlich Bregma (der Punkt, an dem die Nähte der Frontal- und Parietalknochen zusammenkommen) oder Lambda (der Punkt, an dem die Nähte der Parietal- und Hinterhauptsknochen zusammenkommen; Abbildung 1A,B). Durch ein Gratloch in den Schädel oberhalb des geschätzten Ziels kann dann die Zielregion erreicht werden, entweder für die Lieferung von Mikroinjektionen oder Instrumenten mit Kanülen oder optischen Fasern. Aufgrund von Variationen in der Anatomie dieser Nähte und Fehlern in der Lokalisation von Bregma oder Lambda 4,5 variiert die Position der Nullpunkte in Bezug auf das Gehirn von Tier zu Tier. Während kleine Fehler beim Targeting, die sich aus dieser Variabilität ergeben, für große oder nahe gelegene Ziele kein Problem darstellen, sind ihre Auswirkungen für kleinere Interessengebiete, die von den Nullpunkten in den anteroposterioren oder dorsoventralen Ebenen entfernt sind, und / oder bei der Untersuchung von Tieren unterschiedlicher Größe aufgrund von Alter, Belastung und / oder Geschlecht größer. Es gibt mehrere zusätzliche Herausforderungen, die für die Medulla oblongata und die obere Halsschnur einzigartig sind. Erstens sind kleine Änderungen der anteroposterioren Koordinaten aufgrund der Position und Form des Kleinhirns mit signifikanten Änderungen der dorsoventralen Koordinaten relativ zur Dura verbunden (Abbildung 1Bi)2,6,7. Zweitens ist die obere Halsschnur nicht im Schädelenthalten 2. Drittens macht die schräge Position des Hinterhauptbeins und der darüber liegenden Schicht der Nackenmuskulatur2 den stereotaktischen Standardansatz für Strukturen, die sich in der Nähe des Übergangs zwischen Hirnstamm und Rückenmark befinden, noch schwieriger (Abbildung 1Bi). Schließlich sind viele Ziele, die im kaudalen Hirnstamm und in der Halsschnur von Interesse sind, klein2, was präzise und reproduzierbare Injektionen erfordert 8,9.

Ein alternativer Ansatz durch die Cisterna magna umgeht diese Probleme. Die Cisterna magna ist ein großer Raum, der sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt (Abbildung 1A, d.h. der zweite Wirbelknochen)10. Es ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und mit Dura mater10 bedeckt. Dieser Raum zwischen dem Hinterhauptbein und dem Atlas öffnet sich, wenn der Kopf anteroflexiert wird. Es kann erreicht werden, indem man zwischen den darüber liegenden paarigen Bäuchen des Musculus longus capitis navigiert und die dorsale Oberfläche des kaudalen Hirnstamms freilegt. Interessante Regionen können dann basierend auf den Landmarken dieser Regionen selbst ins Visier genommen werden, wenn sie sich in der Nähe der dorsalen Oberfläche befinden. oder durch die Verwendung des Obex, des Punktes, an dem sich der zentrale Kanal in den IV-Ventrikel öffnet, als Nullpunkt für Koordinaten, um tiefere Strukturen zu erreichen. Dieser Ansatz wurde erfolgreich bei einer Vielzahl von Arten eingesetzt, darunter die Ratte11, Katze12, Maus8,9 und der nichtmenschliche Primat13, um auf die ventrale Atmungsgruppe, die medulläre mediale retikuläre Formation, den Kern des Einzeltraktes, die Arealpostrema oder den hypoglossalen Kern abzuzielen. Dieser Ansatz wird jedoch nicht häufig verwendet, da er Kenntnisse der Anatomie, ein spezialisiertes Toolkit und fortgeschrittenere chirurgische Fähigkeiten im Vergleich zum stereotaktischen Standardansatz erfordert.

Hier beschreiben wir einen schrittweisen chirurgischen Ansatz, um den Hirnstamm und das obere Halsband über die Zisterne magna zu erreichen, Orientierungspunkte zu visualisieren, den Nullpunkt zu setzen (Abbildung 2) und die Zielkoordinaten für die stereotaktische Abgabe von Mikroinjektionen in die diskreten Hirnstamm- und Rückenmarksregionen von Interesse zu schätzen und zu optimieren (Abbildung 3). Anschließend besprechen wir die Vor- und Nachteile dieses Ansatzes.

Protocol

Der Autor erklärt, dass das Protokoll den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee am Beth Israel Deaconess Medical Center folgt. 1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und stereotaktischem Rahmen HINWEIS: Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Sterilität wird mit der sterilen Spitzentechnik aufrechterhalten. Installieren Sie den stereotaktischen Arm mit einer Mikropipette oder Spri…

Representative Results

Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, kaudale Hirnstamm- und obere Halsschnurstrukturen anzusprechen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Die Operation, um die Cisterna magna zu erreichen, erfordert Schnitte der Haut, eine dünne Schicht des Trapezmuskels und die Öffnung der Dura mater und wird daher von Mäusen gut vertragen. Es ist besonders effizient und weniger invasiv, wenn es auf mehrere (längs verteilte oder bilaterale) S…

Discussion

Die stereotaktische Standardchirurgie stützt sich häufig auf Schädel-Landmarken, um die Koordinaten der Zielstellen im ZNS1 zu berechnen. Die Zielstandorte werden dann über Gratlöcher erreicht, die durch den Schädelgebohrt werden 1. Diese Methode ist nicht ideal für den kaudalen Hirnstamm, da sich die Zielstellen in der anteroposterioren und dorsoventralen Ebene2 entfernt von den Schädellandmarken befinden und da die Anatomie des Sch…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von R01 NS079623, P01 HL149630 und P01 HL095491 unterstützt.

Materials

Alcohol pad Med-Vet International SKU: MDS090735Z skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45 FST 11251-35 only to grab dura
Betadine pad Med-Vet International SKU:PVP-PAD skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate Thermo Fisher Scientific 488: C34775, 594: C22842 Fluorescent tracer
Clippers Wahl Model MC3, 28915-10 for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp Kopf 1770 to hold glass pipette
Flowmeter Gilmont instruments model # 65 MM to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene Thermo Fisher Scientific F13080 Fluorescent tracer
Heating pad Stoelting 53800M thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit Midmark Inc 93805107 92800131 chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe Exelint International 26028 to administer saline and analgesic
Isoflurane Med-Vet International SKU:RXISO-250 inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer Midmark Inc 91305430 apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2 FST 11223-20 only to clean dura
Medical air, compressed Linde UN 1002 used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR Zoo Pharm LLC Lot # MSR2-211201 analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube Globe Scientific Inc 51628 for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor Stoelting 0051625  adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats FST 91308-12 for suturing
Oxygen regulator Life Support Products S/N 909328, lot 092109 regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed Linde USP UN 1072 provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card not applicable not applicable any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar) World Precision Instruments (WPI) SYS-PV820 For precision solution injection
Saline, sterile Mountainside Medical Equipment H04888-10 to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3 FST 10003-12 to hold scalpel
Scissors, Wagner FST 14070-12 to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box FST 15002-08 scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator Kopf 1760-61 attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate Kopf 1730-B, 1711 frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators Puritan 25-806 10WC absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes Henry Schein 9004686 for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment Puralube P1490 ocular lubricant
Stimulator & Tubing Grass Medical Instruments S44 to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10 Med-Vet International SKU: 10SS for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe FST 11153-10 to hold skin
Surgical gloves Med-Vet International MSG2280Z for asceptic surgery
Surgical microscope Leica Model M320/ F12 for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene Oasis MV-8661 to close the skin
Tegaderm 3M 3M ID 70200749250 provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post Kopf 1725 attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats FST 18200-09, 13003-10 to separate muscles and provide surgical window

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Joshi, K., Kirby, A., Niu, J., VanderHorst, V. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (179), e63344, doi:10.3791/63344 (2022).

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