مصفوفة Optrode للتعديل البصري الوراثي المتزامن والتسجيل العصبي الكهربائي
Summary
هنا ، نقدم طريقة تصنيع نظام optrode مع ألياف بصرية لتوصيل الضوء ومجموعة قطب كهربائي للتسجيل العصبي. في الجسم الحي ، تظهر التجارب مع الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن قناة رودوبسين-2 جدوى النظام للتحفيز البصري الوراثي المتزامن والتسجيل الكهروفسيولوجي.
Abstract
خلال العقد الماضي ، أصبح علم البصريات الوراثي أداة أساسية للتحقيق في الإشارات العصبية بسبب قدرته الفريدة على التعديل العصبي الانتقائي أو الرصد. نظرا لأنه يمكن تعديل أنواع محددة من الخلايا العصبية وراثيا للتعبير عن بروتينات opsin ، فإن علم البصريات الوراثي يمكن من التحفيز البصري أو تثبيط الخلايا العصبية المختارة. كان هناك العديد من التطورات التكنولوجية في النظام البصري لعلم البصريات الوراثية. في الآونة الأخيرة ، اقترح الجمع بين الدليل الموجي البصري لتوصيل الضوء والتسجيل الكهروفسيولوجي لمراقبة الاستجابات العصبية للتحفيز البصري الجيني أو التثبيط في وقت واحد. في هذه الدراسة ، تم تطوير مصفوفة optrode قابلة للزرع (ألياف بصرية 2×2) مع أقطاب كهربائية متعددة القنوات مدمجة.
تم استخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) كمصدر للضوء ، وتم دمج مجموعة من العدسات الدقيقة الدقيقة لتوفير طاقة ضوئية كافية عند طرف الألياف البصرية. يتكون نظام مصفوفة optrode من الجزء القابل للتصرف والجزء القابل لإعادة الاستخدام. يحتوي الجزء القابل للتصرف على ألياف بصرية وأقطاب كهربائية ، في حين أن الجزء القابل لإعادة الاستخدام يحتوي على LED والدوائر الإلكترونية للتحكم في الضوء ومعالجة الإشارات العصبية. يتم تقديم التصميم الجديد لنظام مصفوفة الأوبترود القابلة للزرع في الفيديو المصاحب بالإضافة إلى إجراء جراحة زرع الأوبترود ، وتحفيز الضوء البصري الوراثي ، والتسجيل العصبي الكهروفسيولوجي. أظهرت نتائج التجارب في الجسم الحي بنجاح طفرات عصبية مقفلة زمنيا أثارتها المحفزات الضوئية من الخلايا العصبية المثيرة للحصين من الفئران.
Introduction
يعد تسجيل النشاط العصبي والتحكم فيه أمرا ضروريا لفهم كيفية عمل الدماغ في الشبكة العصبية وعلى المستويات الخلوية. تشمل طرق التسجيل الكهروفسيولوجية التقليدية مشبك التصحيح1،2،3،4 باستخدام ماصة دقيقة وتسجيل خارج الخلية باستخدام أقطاب عصبية دقيقة5،6،7،8. كطريقة تعديل عصبي ، تم استخدام التحفيز الكهربائي بشكل متكرر لتحفيز منطقة الدماغ البؤرية مباشرة من خلال إزالة الاستقطاب المباشر أو غير المباشر للخلايا العصبية. ومع ذلك ، لا يمكن للطريقة الكهربائية التمييز بين أنواع الخلايا العصبية للتسجيل أو التحفيز لأن التيارات الكهربائية تنتشر في جميع الاتجاهات.
كتقنية ناشئة ، بشرت البصريات الوراثية بعصر جديد في فهم كيفية عمل الجهاز العصبي9،10،11،12،13،14،15،16. جوهر التقنيات البصرية الجينية هو استخدام الضوء للتحكم في نشاط بروتينات opsin الحساسة للضوء التي تعبر عنها الخلايا المعدلة وراثيا. وبالتالي ، فإن علم البصريات الوراثي يمكن من التعديل المتطور أو مراقبة الخلايا المختارة وراثيا في الدوائر العصبية المعقدة14,17. وقد استلزم الاستخدام الأوسع للنهج البصري الوراثي التسجيل العصبي المتزامن لتأكيد التعديل العصبي البصري مباشرة. لذلك ، فإن الجهاز المتكامل مع وظائف التحكم في الضوء والتسجيل سيكون ذا قيمة كبيرة16،18،19،20،21،22،23،24،25.
هناك قيود على التحفيز البصري الوراثي التقليدي القائم على الليزر ، والذي يتطلب نظاما ضخما ومكلفا لتوصيل الضوء 26،27،28،29،30. لذلك ، استخدمت بعض المجموعات البحثية مجسات السيليكون القائمة على μLED لتقليل حجم نظام توصيل الضوء31،32،33،34. ومع ذلك ، هناك خطر تلف الدماغ الحراري الناجم عن الاتصال المباشر مع μLEDs بسبب انخفاض كفاءة تحويل الطاقة من المصابيح. تم تطبيق أدلة موجية ضوئية ، مثل الألياف البصرية ، SU-8 ، وأوكسينتريد السيليكون (SiON) ، لتجنب التلف الحراري30،35،36،37،38،39. ومع ذلك ، فإن هذه الاستراتيجية لها أيضا عيب بسبب انخفاض كفاءة الاقتران بين مصادر الضوء والأدلة الموجية.
تم تقديم مجموعة العدسات الدقيقة سابقا لتعزيز كفاءة اقتران الضوء بين مصابيح LED والألياف البصرية40. تم تطوير نظام optrode على أساس تقنيات الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة (MEMS) للتحفيز البصري والتسجيل الكهربائي على مقياس مجهري40. زادت مصفوفة العدسات الدقيقة بين LED والألياف البصرية من كفاءة الإضاءة بمقدار 3.13 ديسيبل. كما هو موضح في الشكل 1 ، يتم محاذاة صفيف الألياف البصرية 2×2 على صفيف microlens 4×4 ، ويتم وضع LED أسفل صفيف microlens. يتم تركيب الألياف البصرية 2×2 بدلا من 4×4 لتقليل تلف الدماغ. يتم وضع مصفوفة قطب التنغستن بجوار مصفوفة الأوبترود باستخدام السيليكون عبر ثقوب للتسجيل الكهروفسيولوجي (الشكل 1B).
يتكون النظام من جزء علوي يمكن التخلص منه وأجزاء سفلية قابلة للفصل. تم تصميم الجزء العلوي القابل للتصرف ، والذي يتضمن مصفوفة الألياف البصرية ، ومصفوفة العدسات الدقيقة ، ومجموعة قطب التنغستن ، ليتم زرعها بشكل دائم في الدماغ لإجراء تجارب في الجسم الحي . يتضمن الجزء السفلي مصدر ضوء LED وخط إمداد طاقة خارجي ، والذي يمكن إزالته بسهولة وإعادة استخدامه لتجربة حيوانية أخرى. يحمي الغطاء البلاستيكي القابل للتوصيل الجزء القابل للتصرف عند إزالة الجزء القابل للفصل.
يتم التحقق من جدوى النظام عن طريق الزرع في أدمغة الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن قناة رودوبسين-2 (ChR2) في الخلايا العصبية الإيجابية للبروتين كيناز II المعتمد على Ca2 + / calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse). تم استخدام أقطاب التسجيل لتسجيل الأنشطة العصبية من الخلايا العصبية الفردية أثناء التحفيز البصري للخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتم التحقق من جدوى نظام التحفيز البصري الوراثي المتزامن والتسجيل الكهروفسيولوجي (الشكل 6). المسامير الكبيرة أثناء تحفيز الضوء هي القطع الأثرية الكهروضوئية التي تحدث في نفس الوقت الذي يتم فيه تحفيز الضوء (الشكل 6A). هذا واضح في العرض المكبر للشكل الموجي في ال?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث والتطوير التكنولوجي المتقارب لتعزيز الإنسان من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (NRF-2019M3C1B8090805) ، وبدعم من منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (رقم 2019R1A2C1088909). نشكر مختبر Seung-Hee Lee في قسم العلوم البيولوجية ، KAIST ، دايجون ، كوريا ، على التكرم بتوفير الفئران المعدلة وراثيا.
Materials
| 5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
| Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
| Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
| Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
| Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
| Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
| Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
| Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
| LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
| MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
| Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
| Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm |
| PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
| Photodiode | Thorlabs | S121C | |
| power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
| Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
| Prism | GraphPad | 5.01 version | |
| Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
| screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
| Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
| Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
| suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
| Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
| Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |
Referenzen
- Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024 (2016).
- Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
- Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
- Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
- Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
- Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
- Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
- Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
- Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
- Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
- Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
- Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
- Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
- Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
- Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
- Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
- Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
- Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
- Oh, K., Sonsi, Y. -. A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
- McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
- Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
- Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , (2015).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
- Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), 725 (2021).
- Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
- Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
- Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
- Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
- Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
- Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
- Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -. W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).
