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Neurowissenschaften

同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ

Published: September 01, 2022
doi:
10.3791/63460
, , , , , , ,
1Department of Electronic and Electrical Engineering,Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory,Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice,Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences,Ewha Womans University

Summary

ここでは、光伝達用光ファイバと神経記録用電極アレイを用いたオプトロードシステムの製造方法について紹介する。チャネルロドプシン-2を発現するトランスジェニックマウスを用いた インビボ 実験は、同時光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのシステムの実現可能性を示す。

Abstract

過去10年間、光遺伝学は、選択的神経調節またはモニタリングの独自の能力のために、神経シグナル伝達の調査に不可欠なツールとなっています。特定のタイプのニューロン細胞をオプシンタンパク質を発現するように遺伝子改変することができるので、オプトジェネティクスは、選択されたニューロンの光刺激または阻害を可能にする。光遺伝学のための光学系にはいくつかの技術的進歩がありました。最近、光送達のための光導波路と電気生理学的記録を組み合わせて、光遺伝学的刺激または阻害に対する神経応答を同時にモニターすることが提案されている。本研究では、マルチチャネル電極を埋め込んだ埋め込み型オプトロードアレイ(2×2光ファイバ)を開発しました。

光源として発光ダイオード(LED)を用い、微細加工したマイクロレンズアレイを集積し、光ファイバの先端に十分な光パワーを与えた。オプトロードアレイシステムは、使い捨て部品と再利用可能な部分で構成されています。使い捨て部品には光ファイバと電極があり、再利用可能な部分には光制御と神経信号処理用のLEDと電子回路があります。移植可能なオプトロードアレイシステムの新規設計は、オプトロド移植手術、光遺伝学的光刺激、および電気生理学的神経記録の手順に加えて、添付のビデオで紹介されている。 in vivo 実験の結果は、マウスの海馬興奮性ニューロンからの光刺激によって誘発される時間ロックされた神経スパイクを首尾よく示した。

Introduction

神経活動の記録と制御は、脳がニューラルネットワークや細胞レベルでどのように機能するかを理解するために不可欠です。従来の電気生理学的記録方法は、マイクロピペットを用いたパッチクランプ1,2,3,4およびマイクロニューラル電極5,6,7,8を用いた細胞外記録を含む。神経調節法として、電気刺激は、神経細胞の直接的または間接的な脱分極を介して焦点脳領域を直接刺激するために頻繁に使用されてきた。しかし、電気的方法は、電流があらゆる方向に広がるため、記録または刺激のための神経細胞型を区別することができない。

新興技術として、光遺伝学は、神経系がどのように機能するかを理解する上で新しい時代を先導しました 9,10,11,12,13,14,15,16.光遺伝学的技術の本質は、遺伝子組み換え細胞によって発現される光感受性オプシンタンパク質の活性を制御するために光を使用することである。したがって、光遺伝学は、複雑な神経回路14、17における遺伝的に選択された細胞の洗練された調節またはモニタリングを可能にする。光遺伝学的アプローチのより広範な使用は、光学的神経調節を直接確認するために同時神経記録を必要としてきた。したがって、光制御および記録機能を備えた統合デバイスは、16、18、19、20、21、22、23、24、25と非常に貴重であろう。

従来のレーザーベースの光遺伝学的刺激には限界があり、これはかさばる高価な光送達システム26、27、28、29、30を必要とする。したがって、いくつかの研究グループは、光送達システム31、32、33、34のサイズを最小限に抑えるためにμLEDベースのシリコンプローブを採用した。しかし、LEDのエネルギー変換効率が低いため、μLEDとの直接接触による熱脳損傷のリスクがあります。光ファイバ、SU-8、および酸窒化ケイ素(SiON)などの光導波路は、熱的損傷を避けるために適用されている30、35、36、37、38、39。しかし、この戦略には、光源と導波路間の結合効率が低いという欠点もあります。

マイクロレンズアレイは、LEDと光ファイバ40との間の光結合効率を高めるために予め導入した。オプトロードシステムは、マイクロスケール40での光刺激および電気記録のためのマイクロエレクトロメカニカルシステム(MEMS)技術に基づいて開発された。LEDと光ファイバ間のマイクロレンズアレイにより、光効率が3.13dB向上しました。 図1に示すように、2×2光ファイバアレイが4×4マイクロレンズアレイ上に整列され、LEDがマイクロレンズアレイの下方に配置される。脳の損傷を軽減するために、4×4の代わりに2×2光ファイバが取り付けられています。タングステン電極アレイは、電気生理学的記録用のシリコンビアホールを使用して、オプトロードアレイに隣接して配置される(図1B)。

システムは、上部の使い捨て部品と取り外し可能な下部部品で構成されています。光ファイバアレイ、マイクロレンズアレイ、タングステン電極アレイを含む上部の使い捨て部品は、 in vivo 実験のために脳に永久に移植されるように設計されています。下部にはLED光源と外部電源ラインが含まれており、簡単に取り外し可能で、別の動物実験に再利用できます。取り外し可能な部分を取り外すと、取り付け可能なプラスチックカバーが使い捨て部品を保護します。

このシステムの実現可能性は、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII陽性ニューロン(CaMKIIα::ChR2マウス)においてチャネルロドプシン-2(ChR2)を発現するトランスジェニックマウスの脳への移植によって検証される。記録電極は、ニューロンの光刺激中に個々のニューロンからの神経活動を記録するために使用された。

Protocol

動物の世話と外科的処置は、梨花女子大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました(番号20-029)。 1. オプトロードアレイの作製(図1、図2) マイクロレンズアレイに光ファイバを取り付けます。 光ファイバのパッシベーションコーティングを除去し、精密?…

Representative Results

オプトロード系は、標的ニューロンを活性化するのに十分な光力を提供するために首尾よく作製される。タングステン電極の微細位置合わせは、孔を介して微細加工されたシリコンを介して達成される。測定された光強度は、50mAの電流を印加したときの光ファイバ先端で3.6mW/mm2 です。マイクロレンズは光効率を3.13dB向上させた。光結合を強化するマイクロレンズアレイのために、印…

Discussion

光遺伝学的刺激と電気生理学的記録を同時に行うためのシステムの実現可能性を検証した(図6)。光刺激中の大きなスパイクは、光刺激と同時に発生する光電アーチファクトです(図6A)。これは、赤色の破線の長方形の波形のズーム表示で明らかです(図6A)。図6Aに示すように、記録された波形から光電気ア…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、韓国国立研究財団(NRF)を通じたConvergent Technology R&D Program for Human Augmentationの支援を受け、科学情報化部(NRF-2019M3C1B8090805)が資金提供し、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(No. 2019R1A2C1088909)の支援を受けました。韓国大田(テジョン)のKAIST生物科学科にあるイ・スンヒ氏の研究室には、トランスジェニックマウスを提供してくださったことに感謝します。

Materials

5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus
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Referenzen

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Keywords: OptrodeOptogenetic ModulationElectrical Neural RecordingLED-based SystemMicrolens ArrayWireless SystemOptogeneticsSpinal Cord InjuryEpilepsyParkinson’s DiseaseAlzheimer’s DiseaseTungsten ElectrodesOptical FibersStereotactic FrameThermal Heating PadLidocaineCraniotomyGround Screw
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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C., Kim, Y., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).
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