JoVE Journal > Neuroscience
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Oprode Array para modulação optogenética simultânea e gravação neural elétrica

Published: September 01, 2022
doi:
10.3791/63460
, , , , , , ,
1Department of Electronic and Electrical Engineering,Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory,Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice,Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences,Ewha Womans University

Summary

Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

Abstract

Durante a última década, a optogenética tornou-se uma ferramenta essencial para a investigação da sinalização neural devido à sua capacidade única de modulação ou monitoramento neural seletivo. Como tipos específicos de células neuronais podem ser geneticamente modificados para expressar proteínas de opsina, a optogenética permite estimulação óptica ou inibição dos neurônios selecionados. Houve vários avanços tecnológicos no sistema óptico para optogenética. Recentemente, foi proposto combinar o guia óptico de ondas para entrega de luz com gravação eletrofisiológica para monitorar simultaneamente as respostas neurais à estimulação ou inibição optogenética. Neste estudo, foi desenvolvido um conjunto de optrode implantável (fibras ópticas 2×2) com eletrodos multicanais incorporados.

Um diodo emissor de luz (LED) foi empregado como fonte de luz, e uma matriz de microluvas microfrágico foi integrada para fornecer energia de luz suficiente na ponta das fibras ópticas. O sistema de matriz optrode compreende a parte descartável e a parte reutilizável. A peça descartável possui fibras ópticas e eletrodos, enquanto a parte reutilizável possui o LED e circuitos eletrônicos para controle de luz e processamento de sinal neural. O novo desenho do sistema de matriz optrode implantável é introduzido no vídeo que acompanha, além do procedimento da cirurgia de implantação de optrode, estimulação de luz optogenética e gravação neural eletrofisiológica. Os resultados de experimentos in vivo mostraram com sucesso picos neurais bloqueados pelo tempo evocados pelos estímulos de luz dos neurônios excitatórios hipocampais de camundongos.

Introduction

Gravar e controlar a atividade neural é essencial para entender como o cérebro funciona em uma rede neural e em níveis celulares. Os métodos convencionais de gravação eletrofisiológica incluem o grampode remendo 1,2,3,4 utilizando um micropipette e gravação extracelular usando eletrodos microneurais 5,6,7,8. Como método de neuromodulação, a estimulação elétrica tem sido frequentemente usada para estimular diretamente uma região cerebral focal através da despolarização direta ou indireta das células neuronais. No entanto, o método elétrico não pode distinguir tipos de células neuronais para gravação ou estimulação porque as correntes elétricas se espalham em todas as direções.

Como tecnologia emergente, a optogenética iniciou uma nova era na compreensão de como funciona o sistema nervoso 9,10,11,12,13,14,15,16. A essência das técnicas optogenéticas é usar a luz para controlar a atividade de proteínas de opsina sensíveis à luz expressas por células geneticamente modificadas. Assim, a optogenética permite a modulação ou monitoramento sofisticado de células geneticamente selecionadas em circuitos neurais complicados14,17. O uso mais amplo da abordagem optogenética exigiu registro neural simultâneo para confirmar diretamente a neuromodulação óptica. Portanto, um dispositivo integrado com funções de controle de luz e gravação seria extremamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Há limitações da estimulação optogenética convencional baseada em laser, que requer um sistema de entrega de luz volumoso e caro 26,27,28,29,30. Portanto, alguns grupos de pesquisa utilizaram sondas de silício baseadas em μLED para minimizar o tamanho do sistema de entrega de luz 31,32,33,34. No entanto, há risco de danos cerebrais térmicos causados pelo contato direto com μLEDs devido à baixa eficiência de conversão de energia dos LEDs. Guias de ondas leves, como fibras ópticas, SU-8 e oxírio de silício (SiON), foram aplicados para evitar danos térmicos 30,35,36,37,38,39. No entanto, essa estratégia também tem uma desvantagem devido à sua baixa eficiência de acoplamento entre fontes de luz e os guias de onda.

O conjunto de microlens foi introduzido anteriormente para aumentar a eficiência de acoplamento de luz entre LEDs e fibras ópticas40. Um sistema optrode foi desenvolvido com base em tecnologias de sistemas microeletromecânicos (MEMS) para estimulação óptica e gravação elétrica em uma microescala40. O conjunto de microlens entre um LED e fibras ópticas aumentou a eficiência da luz em 3,13 dB. Como mostrado na Figura 1, uma matriz de fibra óptica 2×2 está alinhada na matriz de microlens 4×4, e o LED está posicionado abaixo da matriz de microlens. As fibras ópticas 2×2 são montadas em vez de 4×4 para reduzir os danos cerebrais. Uma matriz de eletrodo de tungstênio é posicionada adjacente à matriz optrode usando silício através de orifícios para gravação eletrofisiológica (Figura 1B).

O sistema consiste em uma peça descartável superior e partes inferiores destacáveis. A parte descartável superior, que inclui o conjunto de fibra óptica, a matriz de microlens e a matriz de eletrodo de tungstênio, foi projetada para ser permanentemente implantada no cérebro para experimentos in vivo . A parte inferior inclui uma fonte de luz LED e uma linha de alimentação externa, que é facilmente removível e reutilizável para outro experimento animal. Uma tampa de plástico anexável protege a parte descartável quando a parte destacável é removida.

A viabilidade do sistema é verificada pela implantação nos cérebros de camundongos transgênicos que expressam channelrhodopsin-2 (ChR2) em Neurônios kinase II-positivos de proteína dependente de Ca2+/calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse). Os eletrodos de gravação foram utilizados para registrar as atividades neurais de neurônios individuais durante a estimulação óptica dos neurônios.

Protocol

Os procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Mulher de Ewha (nº 20-029). 1. Preparação de uma matriz optrode (Figura 1 e Figura 2) Conecte fibras ópticas com a matriz de microlens. Remova o revestimento de passivação da fibra óptica e corte-a em pedaço…

Representative Results

O sistema optrode é fabricado com sucesso para fornecer energia de luz suficiente para ativar os neurônios alvo. O fino alinhamento dos eletrodos de tungstênio é alcançado através do silício microfrágico através dos orifícios. A intensidade da luz medida é de 3,6 mW/mm2 na ponta da fibra óptica quando a corrente de 50 mA é aplicada. Os microlens aumentaram a eficiência da luz em 3,13 dB. Devido à matriz de microlens, que melhora o acoplamento de luz, a corrente aplicada é aproximadamente metade…

Discussion

Verificou-se a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e registro eletrofisiológico (Figura 6). Os grandes picos durante a estimulação da luz são artefatos fotoelétricos que ocorrem ao mesmo tempo que a estimulação da luz (Figura 6A). Isso é claro na visão ampliada da forma de onda no retângulo tracejado vermelho (Figura 6A). Como mostrado na Figura 6A, os artefatos…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Convergent Technology P&D Program for Human Augmentation através da National Research Foundation of Korea (NRF), financiada pelo Ministério da Ciência e TIC (NRF-2019M3C1B8090805), e apoiada por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (nº 2019R1A2C10888909). Agradecemos ao laboratório de Seung-Hee Lee no Departamento de Ciências Biológicas, KAIST, Daejeon, Coreia, por fornecer gentilmente os ratos transgênicos.

Materials

5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus
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Keywords: OptrodeOptogenetic ModulationElectrical Neural RecordingLED-based SystemMicrolens ArrayWireless SystemOptogeneticsSpinal Cord InjuryEpilepsyParkinson’s DiseaseAlzheimer’s DiseaseTungsten ElectrodesOptical FibersStereotactic FrameThermal Heating PadLidocaineCraniotomyGround Screw
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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C., Kim, Y., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).
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