التحليل الطيفي لقوة المجموعة بواسطة قوى القص
Summary
التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) هو تقنية قوية للتكشف الميكانيكي والاستشعار في الوقت الفعلي لمجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية في المجالات الفيزيائية الحيوية والاستشعار الحيوي.
Abstract
توفر تقنيات الجزيء الواحد القائمة على مبادئ التألق والميكانوكيميائية حساسية فائقة في الاستشعار البيولوجي. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود قدرات إنتاجية عالية ، فإن تطبيق هذه التقنيات محدود في الفيزياء الحيوية. أظهر التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) إنتاجية عالية في التحقيق في مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية عن طريق تحويل الدراسات الميكانيكية الكيميائية للجزيئات الفردية إلى دراسات المجموعات الجزيئية. في هذا البروتوكول ، تم الكشف عن الهياكل الثانوية للحمض النووي (i-motifs) في تدفق القص بين الدوار والجزء الثابت لطرف مجانس بمعدلات قص تصل إلى 77796 / ثانية. تم توضيح آثار معدلات التدفق والأحجام الجزيئية على قوى القص التي تعاني منها i-motif. كشفت تقنية EFS أيضا عن تقارب الارتباط بين زخارف الحمض النووي i-motifs والأربطة. علاوة على ذلك ، أظهرنا تفاعل كيمياء النقر الذي يمكن تشغيله بواسطة قوة القص (أي كيمياء النقر الميكانيكي). تثبت هذه النتائج فعالية استخدام قوة القص للتحكم في تشكيل الهياكل الجزيئية.
Introduction
في التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد1 (SMFS) ، تمت دراسة الخواص الميكانيكية للهياكل الجزيئية الفردية بواسطة أدوات متطورة مثل مجهر القوة الذرية والملقط البصري والملقط المغناطيسي2،3،4. مقيدة بنفس متطلبات الاتجاه للجزيئات في إعدادات توليد / اكتشاف القوة أو مجال الرؤية الصغير في الملقط المغناطيسي ومجهر قوة الطرد المركزي المصغر (MCF) 5،6،7،8 ، يمكن التحقيق في عدد محدود فقط من الجزيئات في وقت واحد باستخدام SMFS. تمنع الإنتاجية المنخفضة ل SMFS تطبيقه على نطاق واسع في مجال التعرف الجزيئي ، مما يتطلب مشاركة مجموعة كبيرة من الجزيئات.
يوفر تدفق القص حلا محتملا لتطبيق القوى على مجموعة ضخمة من الجزيئات9. في تدفق السائل داخل القناة ، كلما اقتربت من سطح القناة ، كلما كان معدل التدفق أبطأ10. يسبب تدرج سرعة التدفق هذا إجهاد قص مواز لسطح الحدود. عندما يتم وضع جزيء في تدفق القص هذا ، يعيد الجزيء توجيه نفسه بحيث يتوافق محوره الطويل مع اتجاه التدفق ، حيث يتم تطبيق قوة القص على المحور الطويل11. نتيجة لإعادة التوجيه هذه ، من المتوقع أن تتماشى جميع الجزيئات من نفس النوع (حجم وطول المقابض) في نفس الاتجاه بينما تواجه نفس قوة القص.
يصف هذا العمل بروتوكولا لاستخدام تدفق القص هذا لممارسة قوة القص على مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية ، كما يتضح من الحمض النووي i-motif. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء تدفق قص بين الدوار والجزء الثابت في طرف مجانس. وجدت هذه الدراسة أن بنية الحمض النووي المطوية i-motif يمكن أن تتكشف من خلال معدلات القص 9724-97245 s−1. إلى جانب ذلك ، تم العثور على ثابت تفكك يبلغ 36 ميكرومتر بين الرباط L2H2-4OTD و i-motif. وتتفق هذه القيمة مع قيمة 31 ميكرومتر المقاسة بمقايسة إزاحة الهلام12. علاوة على ذلك ، يتم استخدام التقنية الحالية لكشف شكل i-motif ، والذي يمكن أن يعرض النحاس المخلبي (I) لتحفيز تفاعل النقر. وبالتالي يسمح هذا البروتوكول للمرء بالكشف عن مجموعة كبيرة من هياكل i-motif مع أدوات منخفضة التكلفة في وقت معقول (أقصر من 30 دقيقة). بالنظر إلى أن تقنية قوة القص تزيد بشكل كبير من إنتاجية التحليل الطيفي للقوة ، فإننا نسمي هذه التقنية التحليل الطيفي لقوة مجموعة (EFS). يهدف هذا البروتوكول إلى توفير مبادئ توجيهية تجريبية لتسهيل تطبيق نظام EFS القائم على قوة القص.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة بالتحقيق في الوقت الفعلي في تكشف مجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية بواسطة قوة القص. تؤكد النتائج المعروضة هنا أن هياكل الحمض النووي i-motif يمكن أن تتكشف بواسطة قوة القص. كان الكشف عن i-motif المرتبط بالرباط وتفاعلات النقر التي تحركها قوة القص تطبيقات إث…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم [CBET-1904921] والمعاهد الوطنية للصحة [NIH R01CA236350] إلى H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Referenzen
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
