Spettroscopia Ensemble Force mediante Shear Forces
Summary
La spettroscopia di forza d’insieme (EFS) è una tecnica robusta per lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale di un insieme di strutture biomolecolari in campi biofisici e biosensibili.
Abstract
Le tecniche a singola molecola basate sulla fluorescenza e sui principi meccanochimici forniscono una sensibilità superiore nel rilevamento biologico. Tuttavia, a causa della mancanza di elevate capacità di produttività, l’applicazione di queste tecniche è limitata in biofisica. La spettroscopia di forza d’insieme (EFS) ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture molecolari convertendo gli studi meccanochimici delle singole molecole in quelli degli insiemi molecolari. In questo protocollo, le strutture secondarie del DNA (i-motivi) sono state spiegate nel flusso di taglio tra il rotore e lo statore di una punta omogeneizzatore a velocità di taglio fino a 77796/s. Sono stati dimostrati gli effetti delle portate e delle dimensioni molecolari sulle forze di taglio sperimentate dall’i-motif. La tecnica EFS ha anche rivelato l’affinità di legame tra i motivi del DNA e i ligandi. Inoltre, abbiamo dimostrato una reazione chimica del clic che può essere azionata dalla forza di taglio (cioè la chimica meccano-clic). Questi risultati stabiliscono l’efficacia dell’uso della forza di taglio per controllare la conformazione delle strutture molecolari.
Introduction
Nella spettroscopia di forza a singola molecola1 (SMFS), le proprietà meccaniche delle singole strutture molecolari sono state studiate da strumenti sofisticati come il microscopio a forza atomica, le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche 2,3,4. Limitato dallo stesso requisito di direzionalità delle molecole nelle configurazioni di generazione/rilevamento della forza o dal piccolo campo visivo nelle pinzette magnetiche e nel microscopio a forza centrifuga miniaturizzato (MCF)5,6,7,8, solo un numero limitato di molecole può essere studiato simultaneamente utilizzando SMFS. Il basso rendimento di SMFS impedisce la sua ampia applicazione nel campo del riconoscimento molecolare, che richiede il coinvolgimento di un ampio insieme di molecole.
Il flusso di taglio fornisce una potenziale soluzione per applicare forze a un massiccio insieme di molecole9. In un flusso di liquido all’interno di un canale, più vicino alla superficie del canale, più lenta è la portata10. Tale gradiente di velocità del flusso causa sollecitazioni di taglio parallele alla superficie limite. Quando una molecola viene posizionata in questo flusso di taglio, la molecola si riorienta in modo che il suo asse lungo si allinei con la direzione del flusso, poiché la forza di taglio viene applicata all’asse lungo11. Come risultato di questo riorientamento, ci si aspetta che tutte le molecole dello stesso tipo (dimensioni e lunghezza delle maniglie) si allineino nella stessa direzione mentre sperimentano la stessa forza di taglio.
Questo lavoro descrive un protocollo per utilizzare un tale flusso di taglio per esercitare una forza di taglio su un massiccio insieme di strutture molecolari, come esemplificato dal motivo del DNA. In questo protocollo, viene generato un flusso di taglio tra il rotore e lo statore in una punta omogeneizzatore. Il presente studio ha scoperto che la struttura ripiegata del DNA i-motif potrebbe essere spiegata da velocità di taglio di 9724-97245 s-1. Inoltre, è stata trovata una costante di dissociazione di 36 μM tra il ligando L2H2-4OTD e il motivo i. Questo valore è coerente con quello di 31 μM misurato dal saggio di spostamento del gel12. Inoltre, la tecnica corrente viene utilizzata per dispiegare il motivo i, che può esporre il rame chelato (I) per catalizzare una reazione di clic. Questo protocollo consente quindi di dispiegare un ampio set di strutture i-motif con strumenti a basso costo in un tempo ragionevole (inferiore a 30 min). Dato che la tecnica della forza di taglio aumenta drasticamente il throughput della spettroscopia di forza, chiamiamo questa tecnica spettroscopia di forza d’insieme (EFS). Questo protocollo mira a fornire linee guida sperimentali per facilitare l’applicazione di questo EFS basato sulla forza di taglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di studiare in tempo reale lo sviluppo di un insieme di strutture biomolecolari mediante forza di taglio. I risultati qui presentati sottolineano che le strutture del DNA i-motif possono essere spiegate dalla forza di taglio. Lo sviluppo del motivo i-legato al ligando e le reazioni a scatto azionate dalla forza di taglio sono state applicazioni proof-of-concept per questo metodo di spettroscopia a forza d’insieme.
La F…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Science Foundation [CBET-1904921] e dal National Institutes of Health [NIH R01CA236350] a H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Referenzen
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