La spectroscopie de force d’ensemble (EFS) est une technique robuste pour le déploiement mécanique et la détection en temps réel d’un ensemble de structures biomoléculaires dans les domaines biophysiques et biosensoriels.
Les techniques monomoléculaires basées sur la fluorescence et les principes mécanochimiques offrent une sensibilité supérieure dans la détection biologique. Cependant, en raison du manque de capacités de haut débit, l’application de ces techniques est limitée en biophysique. La spectroscopie de force d’ensemble (EFS) a démontré un débit élevé dans l’étude d’un ensemble massif de structures moléculaires en convertissant les études mécanochimiques de molécules individuelles en celles d’ensembles moléculaires. Dans ce protocole, les structures secondaires de l’ADN (i-motifs) ont été déployées dans le flux de cisaillement entre le rotor et le stator d’une pointe d’homogénéisateur à des vitesses de cisaillement allant jusqu’à 77796/s. Les effets des débits et des tailles moléculaires sur les forces de cisaillement subies par le motif i ont été démontrés. La technique EFS a également révélé l’affinité de liaison entre les motifs de l’ADN i et les ligands. De plus, nous avons démontré une réaction de chimie de clic qui peut être actionnée par la force de cisaillement (c’est-à-dire la chimie mécano-clic). Ces résultats établissent l’efficacité de l’utilisation de la force de cisaillement pour contrôler la conformation des structures moléculaires.
En spectroscopie de forcemonomoléculaire 1 (SMFS), les propriétés mécaniques de structures moléculaires individuelles ont été étudiées par des instruments sophistiqués tels que le microscope à force atomique, les pinces optiques et les pinces magnétiques 2,3,4. Limité par la même exigence de directionnalité des molécules dans les configurations de génération de force / détection ou le petit champ de vision dans les pinces magnétiques et le microscope de force de centrifugeuse miniature (MCF)5,6,7,8, seul un nombre limité de molécules peut être étudié simultanément en utilisant SMFS. Le faible débit de SMFS empêche sa large application dans le domaine de la reconnaissance moléculaire, qui nécessite l’implication d’un grand ensemble de molécules.
L’écoulement de cisaillement fournit une solution potentielle pour appliquer des forces à un ensemble massif de molécules9. Dans un écoulement de liquide à l’intérieur d’un canal, plus le débit est proche de la surface du canal, plus le débit10 est lent. Un tel gradient de vitesse d’écoulement provoque une contrainte de cisaillement parallèle à la surface limite. Lorsqu’une molécule est placée dans cet écoulement de cisaillement, la molécule se réoriente de sorte que son axe long s’aligne avec la direction de l’écoulement, car la force de cisaillement est appliquée à l’axe long11. Du fait de cette réorientation, toutes les molécules du même type (taille et longueur des poignées) devraient s’aligner dans la même direction tout en subissant la même force de cisaillement.
Ce travail décrit un protocole permettant d’utiliser un tel flux de cisaillement pour exercer une force de cisaillement sur un ensemble massif de structures moléculaires, comme en témoigne le motif i de l’ADN. Dans ce protocole, un flux de cisaillement est généré entre le rotor et le stator dans une pointe d’homogénéisateur. La présente étude a révélé que la structure du motif i de l’ADN plié pouvait être dépliée par des taux de cisaillement de 9724-97245 s−1. En outre, une constante de dissociation de 36 μM a été trouvée entre le ligand L2H2-4OTD et le i-motif. Cette valeur est cohérente avec celle de 31 μM mesurée par le test de décalage de gel12. De plus, la technique actuelle est utilisée pour déplier le i-motif, qui peut exposer le cuivre chélaté (I) pour catalyser une réaction de clic. Ce protocole permet ainsi de déplier un grand ensemble de structures i-motif avec des instruments à faible coût dans un temps raisonnable (moins de 30 min). Étant donné que la technique de la force de cisaillement augmente considérablement le débit de la spectroscopie de force, nous appelons cette technique spectroscopie de force d’ensemble (EFS). Ce protocole vise à fournir des lignes directrices expérimentales pour faciliter l’application de cet EFS basé sur la force de cisaillement.
Le protocole décrit dans ce manuscrit permet d’étudier en temps réel le déroulement d’un ensemble de structures biomoléculaires par force de cisaillement. Les résultats présentés ici soulignent que les structures à motif d’ADN peuvent être dépliées par la force de cisaillement. Le déploiement du motif i lié au ligand et les réactions de clic actionnées par la force de cisaillement étaient des applications de preuve de concept pour cette méthode de spectroscopie de force d’ensemble.
<p class=…The authors have nothing to disclose.
Ce travail de recherche a été soutenu par la National Science Foundation [CBET-1904921] et les National Institutes of Health [NIH R01CA236350] à H. M.
3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
DNA oligos | IDT | ||
Dye | IDT | /5Cy5/ | |
Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
MES | VWR | VWRCE169-500G | |
Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
Tris | VWR | VWRCE133-100G |