Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

Summary

S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de la subfamilia de receptores S1P (S1PRs). Aquí, se describe una tubería para exponer las estructuras y la función de los S1PR.

Abstract

Los lisofosfolípidos (LPL) son lípidos bioactivos que incluyen esfingosina 1-fosfato (S1P), ácido lisofosfatídico, etc. S1P, un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es uno de los LPL mejor caracterizados que regula una variedad de respuestas fisiológicas celulares a través de vías de señalización mediadas por receptores de esfingosina 1-fosfato (S1PR). Esto implicó que el sistema de señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico potencial notable para trastornos, incluida la esclerosis múltiple (EM), trastornos autoinmunes, cáncer, inflamación e incluso COVID-19. Los S1PR, un pequeño subconjunto de la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A, se componen de cinco subtipos: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 y S1PR5. Sin embargo, la falta de información estructural detallada impide el descubrimiento de fármacos dirigidos a los S1PR. Aquí, aplicamos el método de microscopía crioelectrónica para resolver la estructura del complejo S1P-S1PRs, y dilucidamos el mecanismo de activación, el reconocimiento selectivo de fármacos y el acoplamiento de proteínas G mediante el uso de ensayos funcionales basados en células. Otros receptores de lisofosfolípidos (LPLR) y GPCR también se pueden estudiar utilizando esta estrategia.

Introduction

La esfingosina-1-fosfato (S1P), un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es una molécula de señalización lisofosfatídica ubicua que involucra diversas actividades biológicas, incluyendo el tráfico de linfocitos, el desarrollo vascular, la integridad endotelial y la frecuencia cardíaca ^1,2,3. S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de cinco subtipos de receptores S1P (S1PRs 1-5); Los S1PR se encuentran en una variedad de tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo ^4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de cAMP; S1PR2 y S1PR3 están acoplados con Gi, Gq y G12/13, y S1PR4 y S1PR5 transducen la señal a través de Gi y G12/13⁶.

La señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico crítico para múltiples enfermedades, incluidos los trastornos autoinmunes⁷, la inflamación⁸, el cáncer⁹ e incluso COVID-19¹⁰. En 2010, el fingolimod (FTY720) fue autorizado como un fármaco de primera clase dirigido a S1PR para tratar la esclerosis múltiple (EM) de ^recaída11. Sin embargo, es capaz de unirse a todos los S1PR excepto a S1PR2, mientras que la unión no específica a S1PR3 produce edema de la corteza cerebral, constricción vascular y bronquial, y fuga epitelial pulmonar¹². Como estrategia alternativa para aumentar la selectividad terapéutica, se han producido ligandos específicos de subtipo para el receptor. Siponimod (BAF312) fue aprobado en 2019 para el tratamiento de la EM en recaída¹³; se dirige eficazmente a S1PR1 y S1PR5, mientras que no tiene afinidad por S1PR3, exhibiendo menos efectos secundarios en la práctica clínica¹⁴. En 2020, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos autorizó ozanimod para la terapia de EM¹⁵. Se ha informado que ozanimod tiene una selectividad 25 veces mayor para S1PR1 que para S1PR5¹⁶. En particular, en el contexto de la actual pandemia de COVID-19, se ha descubierto que los fármacos agonistas dirigidos a S1PR pueden utilizarse para tratar COVID-19 mediante el uso de técnicas de terapia inmunomoduladora¹⁷. En comparación con el fingolimod, el ozanimod ha demostrado superioridad en la reducción de los síntomas en pacientes con COVID-19 y ahora está siendo sometido a ensayos clínicos¹⁰. Comprender la base estructural y la función de los S1PR establece una base significativa para desarrollar un fármaco que se dirija selectivamente a los S1PR¹⁸.

Se utilizan muchas técnicas para investigar la información estructural de las biomacromoléculas, incluida la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear (RMN) y la microscopía electrónica (EM). A marzo de 2022, hay más de 180.000 estructuras depositadas en el Protein Databank (PDB), y la mayoría de ellas se han resuelto mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, con la primera estructura de resolución casi atómica de TPRV1 (resolución 3.4 Å) reportada por Yifan Cheng y David Julius en 2013¹⁹, la microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha convertido en una técnica convencional para estructuras de proteínas, y el número total de estructuras EM PDB fue de más de 10,000. Las áreas críticas de avance son el desarrollo de nuevas cámaras para imágenes conocidas como cámaras de detección directa de electrones y nuevos algoritmos de procesamiento de imágenes. Cryo-EM ha revolucionado la biología de la estructura y el descubrimiento de fármacos basados en la estructura en la última década²⁰. Como la comprensión de cómo los complejos macromoleculares cumplen sus complicadas funciones en la célula viva es un tema central en las ciencias biológicas, la crio-EM tiene el potencial de revelar conformaciones de complejos moleculares dinámicos, particularmente para proteínas transmembrana²¹. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la superfamilia más grande de proteínas transmembrana y los objetivos de más del 30% de los productos farmacéuticos comercializados actualmente²². El desarrollo de crio-EM ha contribuido a una explosión de estructuras de alta resolución de complejos de proteínas GPCR-G, permitiendo la determinación estructural de objetivos “intratables” que aún no son accesibles para el análisis cristalográfico de rayos X en el diseño de fármacos²³. Por lo tanto, la aplicación crio-EM proporciona la oportunidad de determinar la estructura tridimensional de los GPCR en condiciones casi nativas cercanas a la resolución atómica²⁴. Los avances en crio-EM permiten visualizar los fundamentos mecanicistas de la estimulación o inhibición de GPCR, y un beneficio adicional en el descubrimiento de los nuevos sitios de unión para la creación de fármacos dirigidos a GPCR²⁵.

Confiando en los tremendos avances de la tecnología crio-EM, hemos identificado estructuras de complejos de señalización S1PR1-, S1PR3- y S1PR5-Gi agonizantes recientemente^26,27. En humanos, los S1PR se encuentran en varios tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo ^4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 3′,5′. S1PR3 y S1PR5 también son capaces de acoplarse con Gi ^6,28. Dado que la activación del receptor acoplado a Gi disminuye la producción de cAMP²⁹, se introdujo un ensayo de inhibición de Gi-amp para medir los efectos de inhibición de cAMP para capturar alteraciones funcionales^26,27. Utilizando una versión mutante de Photinus pyralis luciferase en la que se ha insertado una fracción de proteína de unión a cAMP, este ensayo de cAMP ofrece un método simple y confiable para monitorear la actividad de GPCR a través de cambios en la concentración intracelular de cAMP³⁰. Es un ensayo funcional sensible y no radiactivo y puede aplicarse para monitorear la señalización descendente en tiempo real de una amplia gama de GPCR con fines de descubrimiento de fármacos³¹.

Aquí, se proporciona un resumen de los métodos críticos para resolver los modos de activación y reconocimiento de fármacos de S1PR, que incluyen principalmente manipulaciones crio-EM y un ensayo de cAMP de inhibición Gi. Este artículo tiene como objetivo proporcionar una guía experimental completa para futuras exploraciones en las estructuras y funciones de los GPCR.

Protocol

1. Purificación del complejo proteico S1PRs-G Para purificar el complejo proteico humano S1PRs-G, clonar los ADNc de S1PR1 que carecen de residuos C-terminales 338-382, el tipo salvaje S1PR3, S1PR5 truncado con 345-398 en C-terminal, y el tipo salvaje Gi1 en el vector pFastBac1 y los ADNc del tipo salvaje Gβ1 y Gγ2 en el vector pFastBacdual (Tabla de materiales).NOTA: Todas las construcciones para S1PR también contienen la secuencia de señal de hemaglutinina (HA) segui…

Representative Results

Antes de congelar la muestra del complejo S1PRs-Gi, la muestra purificada debe separarse mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y analizarse con cromatografía de filtración en gel. La figura 2 muestra el complejo S1PR3-Gi como ejemplo. La fracción pico del complejo homogéneo de proteínas GPCR-G generalmente se localizó en ~ 10.5 ml de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2A). El análisis de la página SDS del complejo S1PR3-G…

Discussion

Este protocolo describe una tubería primaria para determinar las estructuras de S1PR mediante crio-EM y medir la potencia de activación de S1PR mediante un ensayo de inhibición de cAMP mediado por Gi. Algunos pasos son cruciales para el éxito del experimento.

Para purificar el complejo S1PRs-Gi, se debe prestar más atención a la calidad del virus y a la salud de las células sf9 . La expresión del receptor se reduce drásticamente en las células sf9 pobres. La salud d…

Materials

0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A