Un saggio di legame proteico della superficie cellulare basato sulla citometria a flusso per valutare la selettività e la specificità di un aptamero antitumorale
Summary
Un passo necessario nello sviluppo dell’aptamero antitumorale è testare il suo legame con il bersaglio. Dimostriamo un saggio basato sulla citometria a flusso per studiare questo legame, sottolineando l’importanza di includere un aptamero di controllo negativo e cellule tumorali positive o negative per quella particolare proteina.
Abstract
Una sfida chiave nello sviluppo di un aptamero antitumorale è determinare in modo efficiente la selettività e la specificità dell’aptamero sviluppato rispetto alla proteina bersaglio. Grazie ai suoi numerosi vantaggi rispetto agli anticorpi monoclonali, lo sviluppo dell’aptamero ha guadagnato un’enorme popolarità tra i ricercatori sul cancro. L’evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX) è il metodo più comune per sviluppare aptameri specifici per le proteine di interesse. Dopo SELEX, un test di legame rapido ed efficiente accelera il processo di identificazione, confermando la selettività e la specificità dell’aptamero.
Questo articolo spiega un saggio di legame basato su citometria a flusso passo-passo di un aptamero specifico per la molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM). La glicoproteina transmembrana EpCAM è sovraespressa nella maggior parte dei carcinomi e svolge un ruolo nell’inizio, nella progressione e nelle metastasi del cancro. Pertanto, è un valido candidato per la somministrazione mirata di farmaci ai tumori. Per valutare la selettività e la specificità dell’aptamero all’EpCAM legato alla membrana, sono necessarie cellule EpCAM-positive e -negative. Inoltre, è richiesto un aptamero EpCAM non vincolante con una lunghezza e una struttura 2D simili all’aptamero con legame EpCAM. Il test di legame include diversi buffer (buffer di blocco, buffer di lavaggio, buffer di incubazione e buffer FACS) e fasi di incubazione.
L’aptamero viene incubato con le linee cellulari. Dopo le fasi di incubazione e lavaggio, le cellule saranno valutate utilizzando un saggio di citometria a flusso sensibile. L’analisi dei risultati mostra il legame dell’aptamero specifico di EpCAM alle cellule EpCAM-positive e non alle cellule EpCAM-negative. Nelle celle EpCAM-positive, questo è rappresentato come uno spostamento di banda nel legame dell’aptamero EpCAM verso destra rispetto al controllo aptamero non vincolante. Nelle cellule EpCAM-negative, le bande corrispondenti di aptameri leganti e non leganti EpCAM si sovrappongono. Ciò dimostra la selettività e la specificità dell’aptamero EpCAM. Mentre questo protocollo è focalizzato sull’aptamero EpCAM, il protocollo è applicabile ad altri aptameri pubblicati.
Introduction
Il cancro è ancora una delle principali cause di mortalità in tutto il mondo1. Nonostante il significativo miglioramento nel trattamento del cancro negli ultimi decenni, lo sviluppo di farmaci antitumorali è ancora un argomento molto dibattuto. Questo perché la chemioterapia, come cardine del trattamento del cancro, è accompagnata da gravi effetti collaterali che limitano la compliance del paziente al trattamento. Inoltre, la resistenza al trattamento del cancro indotta dalla chemioterapia ha limitato la sua applicazione come unica scelta di intervento medico. L’applicazione di anticorpi monoclonali (mAbs) ha introdotto una migliore risposta ai trattamenti contro il cancro2. Il razionale dell’uso di mAbs era quello di migliorare l’efficacia dei chemioterapici e ridurre al minimo le loro reazioni avverse. Tuttavia, anche la somministrazione di mAbs è diventata una sfida. Ciò non era dovuto solo alle reazioni immunologiche indotte da mAb, ma anche ai costosi costi di produzione dipendenti dagli animali e alle difficili condizionidi conservazione 3. L’introduzione degli aptameri nel 19904 ha sollevato nuove speranze nel trattamento del cancro, poiché l’applicazione degli aptameri potrebbe affrontare le sfide associate ai mAbs.
Gli aptameri sono brevi sequenze di acido nucleico prodotte specificamente per un determinato bersaglio. L’evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX) è un metodo comune nella produzione di aptameri In SELEX, la proteina di interesse viene incubata con una libreria di sequenze nucleotidiche casuali e, attraverso una serie di cicli iterativi, l’aptamero specifico per quella proteina viene purificato. Gli aptameri hanno selettività e specificità target simili ai mAbs, e quindi lo sviluppo di farmaci in questo campo mostra promettenti applicazioni future. Gli aptameri specifici per i biomarcatori tumorali potrebbero essere applicati come singoli farmaci e strumenti diagnostici per il cancro 5,6,7. A causa della loro struttura di dimensioni nanometriche, questi aptameri potrebbero anche agire come vettori di farmaci per fornire agenti citotossici specificamente al tumore8. Ciò aumenterebbe l’efficacia della somministrazione mirata di farmaci e ridurrebbe le reazioni avverse fuori bersaglio associate alla chemioterapia. Inoltre, questi nanofarmaci hanno un’elevata penetrazione tissutale, che li rende un candidato desiderabile per la somministrazione e il trattamento di farmaci per tumori profondi. Gli aptameri possono anche essere progettati per colpire i trasportatori espressi sulla barriera emato-encefalica (BBB) per migliorare la somministrazione di farmaci ai tumori cerebrali9. Un buon esempio di tale aptamero sono gli aptameri bifunzionali, che prendono di mira il recettore della transferrina (TfR)10 per migliorare la somministrazione del farmaco attraverso la BBB e forniscono un carico utile di farmaci citotossici alle cellule tumorali11.
Nonostante tutti i vantaggi degli aptameri, lo sviluppo di farmaci in questo campo non ha ancora prodotto un farmaco antitumorale commercializzato e di successo. Una ragione di ciò potrebbe essere la mancanza di metodi standard e riproducibili che potrebbero essere seguiti a livello globale dai ricercatori del settore. In questo articolo, viene dimostrato un protocollo passo-passo di un aptamero che si lega a una proteina nativa espressa sulla superficie cellulare. Questo protocollo è un passo prerequisito nella valutazione preclinica degli aptameri antitumorali. Il test viene eseguito per mostrare la selettività e la specificità dell’aptamero purificato raccolto da SELEX o una sequenza di aptameri pubblicata per la conferma della selettività e della specificità. Questo test basato sulla citometria a flusso è un test rapido, affidabile e sensibile che mostra accuratamente la selettività e la specificità dell’aptamero, dove l’aptamero viene testato contro le proteine sulla superficie cellulare12,13,14. Questo metodo è dimostrato utilizzando il legame di un aptamero specifico per EpCAM mostrato in questo articolo15. EpCAM, come glicoproteina transmembrana, svolge ruoli nella segnalazione, progressione, migrazione e metastasi delle cellule tumorali16,17. Per mostrare la selettività e la specificità di questo aptamero, sono state utilizzate cellule tumorali EpCAM-positive e -negative. L’aptamero specifico EpCAM precedentemente sviluppato, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), e un aptamero di controllo negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), sono stati utilizzati rispettivamente come aptameri leganti e non leganti EpCAM10. L’estremità 3′ di TEPP e TENN è stata etichettata con un fluoroforo TYE665.
TEPP è un aptamero bifunzionale che ha come target EpCAM da un’estremità e TfR dall’altra. Ciò ha reso TEPP un candidato adatto per la somministrazione di farmaci ai tumori cerebrali EpCAM + . Utilizzando la sua estremità specifica per TfR, TEPP attraversa la barriera emato-encefalica e, utilizzando l’estremità specifica di EpCAM, trova il tumore e consegna il suo carico (ad esempio, farmaci citotossici) al tumore. TENN ha una lunghezza e una struttura 2D simili a TEPP, ma non ha affinità per l’EpCAM o il TfR, e quindi è un aptamero di controllo negativo adatto. Utilizzando TEPP e TENN, testare il legame di un aptamero alla proteina bersaglio usando la citometria a flusso è mostrato in questo articolo. Questo protocollo si applica allo sviluppo di aptameri cellulo-specifici. È applicabile anche a ulteriori analisi complementari e di conferma delle sequenze aptameri disponibili in letteratura. Il protocollo può essere utilizzato anche da coloro che sono nuovi nel campo degli aptameri che stanno cercando di utilizzare un aptamero precedentemente pubblicato per i loro scopi di ricerca e sviluppo (R & S). In questo articolo vengono studiate due sequenze di aptameri disponibili in letteratura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sfida principale con lo sviluppo di nuovi aptameri è la mancanza di linee guida standard che si applicano alle diverse fasi di questo processo. McKeague et al. hanno recentemente dimostrato alcune delle sfide associate, che portano a presentazioni poco chiare dei dati nelle pubblicazioni e alla mancata replica della ricerca. Hanno proposto linee guida fondamentali necessarie per la caratterizzazione degli aptameri19. Un test di legame dell’aptamero è un passo fondamentale nello screening e / …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il finanziamento SEED dell’Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT), il programma “Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship” presso la Deakin University e la “Australian Government Research Training Program Scholarship”.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
Referenzen
- Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development – Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D’huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
