Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

Summary

Um passo necessário no desenvolvimento do aptâmero anticâncer é testar sua ligação ao alvo. Demonstramos um ensaio baseado em citometria de fluxo para estudar essa ligação, enfatizando a importância de incluir um aptâmero de controle negativo e células cancerígenas que são positivas ou negativas para essa proteína em particular.

Abstract

Um dos principais desafios no desenvolvimento de um aptâmero anticâncer é determinar eficientemente a seletividade e a especificidade do aptâmero desenvolvido para a proteína alvo. Devido às suas várias vantagens sobre os anticorpos monoclonais, o desenvolvimento do aptâmero ganhou enorme popularidade entre os pesquisadores do câncer. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o método mais comum de desenvolvimento de aptâmeros específicos para proteínas de interesse. Após o SELEX, um ensaio de ligação rápido e eficiente acelera o processo de identificação, confirmando a seletividade e especificidade do aptâmero.

Este artigo explica um ensaio de ligação baseado em citometria de fluxo passo-a-passo de um aptâmero específico para molécula de adesão celular epitelial (EpCAM). A glicoproteína transmembrana EpCAM é superexpressa na maioria dos carcinomas e desempenha papéis no início, progressão e metástase do câncer. Portanto, é um candidato valioso para a entrega de medicamentos direcionados aos tumores. Para avaliar a seletividade e a especificidade do aptâmero para a EpCAM ligada à membrana, são necessárias células positivas e negativas para EpCAM. Além disso, é necessário um aptâmero EpCAM não vinculativo com um comprimento e estrutura 2-dimensional (2D) semelhantes ao aptâmero de ligação ao EpCAM. O ensaio de ligação inclui diferentes buffers (buffer de bloqueio, buffer de lavagem, buffer de incubação e buffer FACS) e etapas de incubação.

O aptâmero é incubado com as linhas celulares. Após as etapas de incubação e lavagem, as células serão avaliadas por meio de um ensaio de citometria de fluxo sensível. A análise dos resultados mostra a ligação do aptâmero específico do EpCAM às células positivas para EpCAM e não às células negativas para EpCAM. Em células positivas para EpCAM, isso é descrito como um deslocamento de banda na ligação do aptâmero EpCAM à direita em comparação com o controle do aptâmero não ligante. Em células EpCAM-negativas, as bandas correspondentes de aptâmeros de ligação e não ligação a EpCAM se sobrepõem. Isso demonstra a seletividade e a especificidade do aptamer EpCAM. Enquanto este protocolo é focado no aptâmero EpCAM, o protocolo é aplicável a outros aptâmeros publicados.

Introduction

O câncer ainda é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo¹. Apesar da melhoria significativa no tratamento do câncer nas últimas décadas, o desenvolvimento de medicamentos anticâncer ainda é um tópico altamente debatido. Isso ocorre porque a quimioterapia, como a base do tratamento do câncer, é acompanhada por efeitos colaterais graves que limitam a adesão do paciente ao tratamento. Além disso, a resistência ao tratamento do câncer induzida pela quimioterapia restringiu sua aplicação como a única escolha de intervenção médica. A aplicação de anticorpos monoclonais (mAbs) introduziu uma resposta aprimorada aos tratamentos contra o câncer². A lógica do uso de mAbs foi melhorar a eficácia dos quimioterápicos e minimizar suas reações adversas. No entanto, a administração de mAbs também se tornou um desafio. Isso não ocorreu apenas por causa das reações imunológicas induzidas por mAb, mas também devido aos custos de produção caros e dependentes de animais e às difíceis condições de armazenamento³. A introdução dos aptâmeros^{na década de} 19904 levantou novas esperanças no tratamento do câncer, já que a aplicação de aptâmeros poderia enfrentar os desafios associados ao mAbs.

Aptamers são sequências curtas de ácidos nucleicos que são produzidas especificamente para um determinado alvo. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é um método comum na produção de aptâmeros. No SELEX, a proteína de interesse é incubada com uma biblioteca de sequências aleatórias de nucleotídeos e, através de uma série de ciclos iterativos, o aptâmero específico para essa proteína é purificado. Os aptâmeros têm seletividade e especificidade de alvo semelhantes aos mAbs e, portanto, o desenvolvimento de medicamentos neste campo mostra aplicações futuras promissoras. Aptamers específicos para biomarcadores de câncer poderiam ser aplicados como medicamentos únicos e ferramentas de diagnóstico de câncer ^5,6,7. Devido à sua estrutura nanométrica, esses aptâmeros também poderiam atuar como portadores de fármacos para fornecer agentes citotóxicos especificamente ao tumor⁸. Isso aumentaria a eficácia da administração direcionada de medicamentos e diminuiria as reações adversas fora do alvo associadas à quimioterapia. Além disso, esses nanomedicamentos têm uma alta penetração tecidual, o que os torna um candidato desejável para a entrega e tratamento de medicamentos de tumores profundos. Os aptâmeros também podem ser projetados para atingir os transportadores expressos na barreira hematoencefálica (BBB) para melhorar a entrega de drogas a tumores cerebrais⁹. Um bom exemplo de tal aptâmero são os aptâmeros bifuncionais, visando o receptor de transferrina (TfR)¹⁰ para melhorar a entrega de drogas em todo o BBB e entregando uma carga útil de drogas citotóxicas às células tumorais¹¹.

Apesar de todas as vantagens dos aptâmeros, o desenvolvimento de medicamentos neste campo ainda não produziu um medicamento anticâncer comercializado e bem-sucedido. Uma razão para isso pode ser a falta de métodos padrão e reprodutíveis que poderiam ser seguidos globalmente por pesquisadores da área. Neste trabalho, um protocolo passo-a-passo de um aptâmero se ligando a uma proteína nativa expressa na superfície celular é demonstrado. Este protocolo é uma etapa pré-requisito na avaliação pré-clínica de aptâmeros anticancerígenos. O ensaio é realizado para mostrar a seletividade e especificidade do aptâmero purificado coletado do SELEX ou uma sequência de aptâmeros publicada para confirmação da seletividade e especificidade. Este ensaio baseado em citometria de fluxo é um ensaio rápido, confiável e sensível que mostra com precisão a seletividade e a especificidade do aptâmero, onde o aptâmero está sendo testado contra proteínas na superfície celular^12,13,14. Este método é demonstrado usando a ligação de um aptâmero específico para EpCAM mostrado neste trabalho¹⁵. A EpCAM, como glicoproteína transmembrana, desempenha papéis na sinalização, progressão, migração e metástase de células tumorais^16,17. Para mostrar a seletividade e especificidade deste aptâmero, foram utilizadas células cancerígenas positivas e negativas para EpCAM. O aptâmero específico de EpCAM previamente desenvolvido, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), e um aptâmero controle negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), foram utilizados como aptâmeros ligantes e não ligantes de EpCAM, respectivamente¹⁰. A extremidade 3′ do TEPP e do TENN foi marcada com um fluoróforo TYE665.

O TEPP é um aptâmero bifuncional que tem como alvo o EpCAM de uma extremidade e o TfR do outro. Isso tornou o TEPP um candidato adequado para a administração de medicamentos para tumores cerebrais ^EpCAM +. Usando sua extremidade específica da TfR, a TEPP atravessa a barreira hematoencefálica e, usando a extremidade específica da EpCAM, encontra o tumor e entrega sua carga (por exemplo, drogas citotóxicas) ao tumor. O TENN tem um comprimento e uma estrutura 2D semelhantes ao TEPP, mas não tem afinidade com o EpCAM ou TfR e, portanto, é um aptâmero de controle negativo adequado. Usando TEPP e TENN, testar a ligação de um aptâmero à proteína-alvo usando citometria de fluxo é mostrado neste artigo. Este protocolo aplica-se ao desenvolvimento de aptâmeros específicos de células. Também é aplicável a outras análises complementares e de confirmação das sequências de aptâmeros disponíveis na literatura. O protocolo também pode ser usado por aqueles novos no campo do aptâmero que estão procurando usar um aptâmero publicado anteriormente para seus fins de pesquisa e desenvolvimento (P & D). Neste trabalho, são estudadas duas sequências de aptâmeros disponíveis na literatura.

Protocol

NOTA: Antes de iniciar o experimento, use equipamentos de proteção individual, incluindo um jaleco, luvas e óculos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, reagentes, equipamentos e software usados neste protocolo. 1. Buffers necessários para o ensaio Preparar os buffers necessários para este experimento – o buffer SELEX necessário para dobrar aptâmeros, Blocking Buffer (BB), Wash Buffer (WB) e Binding Buffer (BiB) …

Representative Results

Um aspecto importante da descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos é garantir a seletividade e a especificidade do candidato a medicamento. Isso significa que o candidato a medicamento deve ser capaz de discriminar entre diferentes células e afetar apenas a população celular de interesse (seletividade). A seletividade é estudada usando linhagens celulares que diferem em termos de expressão da proteína de interesse. Neste estudo, as linhagens celulares MDA-MB-231 e HEK 293T foram escolhidas como células E…

Discussion

O principal desafio com o desenvolvimento de novos aptâmeros é a falta de diretrizes padrão que se aplicam a diferentes etapas desse processo. McKeague et al. demonstraram recentemente alguns dos desafios associados, que levam a apresentações pouco claras de dados em publicações e falha em replicar a pesquisa. Propuseram diretrizes fundamentais necessárias para a consideração na caracterização dos aptâmeros¹⁹. Um ensaio de ligação de aptâmeros é uma etapa crítica na triagem e/ou …

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube	Greiner Bio One	188271
5 mL serological pipettes	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
Bright-line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
Foetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	N/A
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black	Greiner Bio One	655076
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets	Life Technologies	18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water	Milli-Q
T75 Cell Culture flask	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
Trypan Blue Solution	Life Technologies	15250061
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054