Анализ связывания белка клеточной поверхности на поверхности проточной цитометрии для оценки селективности и специфичности противоопухолевого аптамера
Summary
Необходимым шагом в разработке противоопухолевого аптамера является проверка его связывания с мишенью. Мы демонстрируем анализ на основе проточной цитометрии для изучения этого связывания, подчеркивая важность включения отрицательного контрольного аптамера и раковых клеток, которые являются положительными или отрицательными для этого конкретного белка.
Abstract
Ключевой задачей при разработке противоопухолевого аптамера является эффективное определение селективности и специфичности разработанного аптамера к белку-мишени. Благодаря своим преимуществам перед моноклональными антителами, разработка аптамера приобрела огромную популярность среди исследователей рака. Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) является наиболее распространенным методом разработки аптамеров, специфичных для интересующих белков. Следуя SELEX, быстрый и эффективный связывающий анализ ускоряет процесс идентификации, подтверждая селективность и специфичность аптамера.
В этой статье объясняется пошаговый проточный цитометрический анализ связывания аптамера, специфичного для молекулы клеточной адгезии эпителия (EpCAM). Трансмембранный гликопротеин EpCAM чрезмерно экспрессируется в большинстве карцином и играет роль в инициации, прогрессировании и метастазировании рака. Поэтому он является ценным кандидатом для адресной доставки лекарств к опухолям. Для оценки селективности и специфичности аптамера к мембранно-связанному EpCAM требуются EpCAM-положительные и -отрицательные клетки. Кроме того, требуется несвязывающий аптамер EpCAM с аналогичной длиной и 2-мерной (2D) структурой, что и EpCAM-связывающий аптамер. Анализ связывания включает в себя различные буферы (блокирующий буфер, буфер промывки, буфер инкубации и буфер FACS) и этапы инкубации.
Аптамер инкубируется с клеточными линиями. После этапов инкубации и промывки клетки будут оценены с использованием чувствительного анализа проточной цитометрии. Анализ результатов показывает связывание EpCAM-специфического аптамера с EpCAM-положительными клетками, а не с EpCAM-отрицательными клетками. В EpCAM-положительных клетках это изображается как сдвиг полосы в связывании аптамера EpCAM вправо по сравнению с несвязывающим контролем аптамера. В EpCAM-отрицательных клетках соответствующие полосы EpCAM-связывающих и -несвязывающих аптамеров перекрываются. Это демонстрирует избирательность и специфичность аптамера EpCAM. Хотя этот протокол ориентирован на аптамер EpCAM, протокол применим к другим опубликованным аптамерам.
Introduction
Рак по-прежнему является одной из ведущих причин смертности во всем мире1. Несмотря на значительное улучшение лечения рака в последние десятилетия, разработка противоопухолевых препаратов по-прежнему является весьма обсуждаемой темой. Это связано с тем, что химиотерапия, как основа лечения рака, сопровождается серьезными побочными эффектами, которые ограничивают соблюдение пациентом лечения. Кроме того, вызванная химиотерапией устойчивость рака к лечению ограничила его применение в качестве единственного выбора медицинского вмешательства. Применение моноклональных антител (mAbs) вводило усиленный ответ на лечение рака2. Обоснование применения mAbs заключалось в повышении эффективности химиотерапевтических средств и минимизации их побочных реакций. Тем не менее, администрирование mAbs также стало проблемой. Это произошло не только из-за иммунологических реакций, вызванных mAb, но и из-за зависящих от животных и дорогостоящих производственных затрат и сложных условий хранения3. Внедрение аптамеров в 1990-х годах4 породило новые надежды в лечении рака, поскольку применение аптамеров может решить проблемы, связанные с mAbs.
Аптамеры представляют собой короткие последовательности нуклеиновых кислот, которые специально производятся для определенной мишени. Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) является распространенным методом в производстве аптамеров. В SELEX интересующий белок инкубируется с библиотекой случайных нуклеотидных последовательностей, и через серию итеративных циклов аптамер, специфичный для этого белка, очищается. Аптамеры имеют аналогичную селективность и специфичность мишеней с mAbs, и поэтому разработка лекарств в этой области показывает многообещающие будущие применения. Аптамеры, специфичные для биомаркеров рака, могут применяться как отдельные препараты и инструменты диагностики рака 5,6,7. Из-за их наноразмерной структуры эти аптамеры могут также выступать в качестве носителей лекарств для доставки цитотоксических агентов конкретно к опухоли8. Это повысит эффективность целевой доставки лекарств и уменьшит связанные с химиотерапией побочные реакции. Кроме того, эти нанолекарства обладают высоким проникновением в ткани, что делает их желательным кандидатом для доставки и лечения препаратов с глубокой опухолью. Аптамеры также могут быть разработаны для нацеливания на транспортеры, экспрессируемые на гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ), для улучшения доставки лекарств к опухолям головного мозга9. Хорошим примером такого аптамера являются бифункциональные аптамеры, нацеленные на рецептор трансферрина (TfR)10 для улучшения доставки лекарств через ГЭБ и доставляющие полезную нагрузку цитотоксического препарата к опухолевым клеткам11.
Несмотря на все преимущества аптамеров, разработка лекарств в этой области еще не дала продаваемого, успешного противоопухолевого препарата. Одной из причин этого может быть отсутствие стандартных и воспроизводимых методов, которым могли бы следовать исследователи в этой области во всем мире. В этой статье продемонстрирован пошаговый протокол связывания аптамера с нативным белком, экспрессируемым на поверхности клетки. Этот протокол является обязательным этапом доклинической оценки противоопухолевых аптамеров. Анализ проводится, чтобы показать селективность и специфичность очищенного аптамера, собранного из SELEX или опубликованной последовательности аптамеров для подтверждения селективности и специфичности. Этот проточный цитометрический анализ представляет собой быстрый, надежный, чувствительный анализ, который точно показывает селективность и специфичность аптамера, где аптамер тестируется против белков на поверхности клетки 12,13,14. Этот метод продемонстрирован с использованием связывания аптамера, специфичного для EpCAM, показанного в настоящем документе15. EpCAM, как трансмембранный гликопротеин, играет роль в передаче сигналов опухолевых клеток, прогрессировании, миграции и метастазировании16,17. Чтобы показать селективность и специфичность этого аптамера, использовались EpCAM-положительные и -отрицательные раковые клетки. Ранее разработанный специфический аптамер EpCAM, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), и отрицательный контрольный аптамер, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), были использованы в качестве EpCAM-связывающих и -несвязывающих аптамеров, соответственно10. 3′-дюймовый конец TEPP и TENN были помечены флуорофором TYE665.
TEPP – это бифункциональный аптамер, который нацелен на EpCAM с одного конца и TfR на другом. Это сделало TEPP подходящим кандидатом для доставки лекарств к опухолям головного мозга EpCAM+ . Используя свой TfR-специфический конец, TEPP пересекает гематоэнцефалический барьер и, используя EpCAM-специфический конец, находит опухоль и доставляет ее груз (например, цитотоксические препараты) к опухоли. TENN имеет такую же длину и 2D-структуру, как TEPP, но он не имеет сродства к EpCAM или TfR и, следовательно, является подходящим отрицательным управляющим аптамером. Используя TEPP и TENN, тестирование связывания аптамера с целевым белком с помощью проточной цитометрии показано в этой статье. Этот протокол применяется к разработке клеточных аптамеров. Он также применим к дальнейшим дополнительным и подтверждающим анализам последовательностей аптамеров, имеющихся в литературе. Протокол также может быть использован новичками в области аптамеров, которые рассматривают возможность использования ранее опубликованного аптамера для своих целей исследований и разработок (НИОКР). В данной работе исследуются две аптамерные последовательности, имеющиеся в литературе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключевой проблемой при разработке новых аптамеров является отсутствие стандартных руководящих принципов, которые применяются к различным этапам этого процесса. McKeague et al. недавно продемонстрировали некоторые из связанных с этим проблем, которые приводят к неясному представлению данн…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают финансирование Seed Института психического и физического здоровья и клинического перевода (IMPACT), программу «Стипендия Альфреда Дикина для постдокторских исследований» в Университете Дикина и «Стипендию Австралийской правительственной исследовательской учебной программы».
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
Referenzen
- Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development – Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D’huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
