המטרה כאן היא להתוות פרוטוקול לחקר המנגנונים של דיסביוזיס במחלות לב וכלי דם. מאמר זה דן כיצד לאסוף ולהשתיל דגימות צואה של מורין, לבודד מעיים ולהשתמש בשיטת “סוויס-רול”, ואחריה טכניקות של צביעת מערכת החיסון כדי לחקור שינויים במערכת העיכול.
דיסביוזה של מיקרוביוטת המעי ממלאת תפקיד בפתופיזיולוגיה של הפרעות קרדיווסקולריות ומטבוליות, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. זוהי אפשרות טיפול בטוחה עבור חולים עם זיהום חוזר Clostridium difficile . מחקרים פרה-קליניים מראים כי מניפולציה של מיקרוביוטת המעי היא כלי שימושי לחקר הקשר המכניסטי בין דיסביוזה למחלות. השתלת מיקרוביוטה בצואה עשויה לעזור להבהיר טיפולים חדשניים הממוקדים במיקרוביוטה של המעי לניהול וטיפול במחלות לב-מטבוליות. למרות אחוזי הצלחה גבוהים במכרסמים, עדיין קיימים שינויים תרגומיים הקשורים להשתלה. המטרה כאן היא לספק הדרכה בחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. במחקר זה מתואר פרוטוקול מפורט לאיסוף, טיפול, עיבוד והשתלה של מיקרוביוטה צואתית במחקרי מורין. שלבי האיסוף והעיבוד מתוארים הן עבור תורמים אנושיים והן עבור תורמי מכרסמים. לבסוף, אנו מתארים שימוש בשילוב של טכניקות גלגול וצביעת חיסון שוויצריות כדי להעריך מורפולוגיה ספציפית למעי ושינויים בשלמות במחלות לב וכלי דם ובמנגנוני מיקרוביוטה קשורים של המעי.
הפרעות קרדיומטבוליות, כולל מחלות לב ושבץ, הן סיבות המוות המובילות בעולם1. חוסר פעילות גופנית, תזונה לקויה, גיל מתקדם וגנטיקה מווסתים את הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. עדויות מצטברות תומכות ברעיון שמיקרוביוטת המעי משפיעה על הפרעות לב וכלי דם והפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג2, השמנת יתר3 ויתר לחץ דם4, מה שעשוי להיות המפתח לפיתוח גישות טיפוליות חדשות למחלות אלה.
המנגנונים המדויקים שבאמצעותם המיקרוביוטה גורמת למחלות עדיין אינם ידועים, והמחקרים הנוכחיים משתנים מאוד, בין היתר בשל הבדלים מתודולוגיים. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. FMT נמצא בשימוש נרחב במחקרים בבעלי חיים כדי לגרום או לדכא פנוטיפ. לדוגמה, צריכת קלוריות ומטבוליזם גלוקוז ניתן לווסת על ידי העברת חומר צואתי מתורם חולה למקבל בריא 5,6. בבני אדם, FMT הוכח כאפשרות טיפול בטוחה לחולים עם זיהום חוזר של Clostridium difficile 7. עדויות התומכות בשימוש בו בניהול מחלות לב וכלי דם מתגלות; לדוגמה, FMT מחולי תסמונת רזה לתסמונת מטבולית משפר את הרגישות לאינסולין8. דיסביוזיס של המעי נקשר גם ליתר לחץ דם הן במחקרים בבני אדם והן במחקריםעל מכרסמים 9,10,11. FMT מעכברים שניזונו מתזונה עשירה במלח בעכברים נטולי חיידקים גורם למושתלים לדלקת וליתר לחץ דם12.
למרות השיעור הגבוה של הצלחה FMT במכרסמים, עדיין נותרו אתגרים תרגומיים. ניסויים קליניים המשתמשים ב- FMT לטיפול בהשמנת יתר ובתסמונת מטבולית מצביעים על השפעות מינימליות או ללא השפעות כלל על הפרעות אלה13,14,15. לפיכך, נדרשים מחקרים נוספים כדי לזהות דרכים טיפוליות נוספות המכוונות למיקרוביוטה של המעי לטיפול בהפרעות קרדיומטבוליות. רוב העדויות הזמינות על מיקרוביוטת המעי ומחלות לב וכלי דם הן אסוציאטיביות. הפרוטוקול המתואר דן כיצד להשתמש בשילוב של FMT וטכניקת גלגול שוויצרית כדי להראות קשר בין מחלות למיקרוביוטה של המעי ולהעריך ישירות את שלמות כל חלקי המעי16,17,18.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק הדרכה לחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. פרוטוקול זה מספק פרטים נוספים ושיקולים מרכזיים בתכנון הניסוי כדי לקדם תרגום פיזיולוגי ולהגביר את הקשיחות והשחזור של הממצאים.
גישה חשובה לחקר התפקיד הסיבתי של מיקרוביוטת המעי במחלות לב וכלי דם ומחלות מטבוליות היא להעביר את המיקרוביוטה הכוללת או מינים נבחרים בעלי עניין לעכברים נטולי חיידקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאיסוף דגימות צואה מבני אדם ומעכברים ששוכנו באופן קונבנציונלי בעכברים נטולי חיידקים כדי ל…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (ל- A.K.) מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום; מענק איגוד הלב האמריקאי POST903428 (ל- J.A.I.); ומענקים של המכון הלאומי ללב, ריאות ודם K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (לא.ק.), ומענק NIH 1P01HL116263 (ל- V.K). איור 1 נוצר באמצעות Biorender.
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |