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Abstract
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Immunologie und Infektion

쥐 분변 분리 및 미생물군 이식

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64310
, , ,
1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine Vanderbilt University Medical Center and Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University, 2Division of Pediatric Nephrology Department of Pediatrics,Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Pathology, Microbiology, and Immunology,Vanderbilt University Medical Center

Summary

여기서 목표는 심혈관 질환에서 dysbiosis의 메커니즘을 조사하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 논문은 쥐 분변 샘플을 무균적으로 수집 및 이식하고, 장을 분리하고, “Swiss-roll” 방법을 사용한 다음 면역염색 기술을 사용하여 위장관의 변화를 조사하는 방법에 대해 설명합니다.

Abstract

장내 미생물 dysbiosis는 심혈관 및 대사 장애의 병태생리학에서 중요한 역할을 하지만 그 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. 재발성 클로스트리디움 디피실 감염 환자에게 안전한 치료 옵션입니다. 전임상 연구에 따르면 장내 미생물군을 조작하는 것이 dysbiosis와 질병 사이의 기계적 연관성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 분변 미생물군 이식은 심혈관 질환의 관리 및 치료를 위한 새로운 장내 미생물군 표적 치료제를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 설치류의 높은 성공률에도 불구하고 이식과 관련된 번역 변화가 남아 있습니다. 여기서 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하는 데 지침을 제공하는 것입니다. 이 연구에서는 쥐 연구에서 분변 미생물총의 수집, 취급, 처리 및 이식에 대한 자세한 프로토콜이 설명됩니다. 수집 및 처리 단계는 인간 및 설치류 기증자 모두에 대해 설명됩니다. 마지막으로, 우리는 심혈관 질환 및 관련 장내 미생물군 메커니즘의 장 특이적 형태 및 무결성 변화를 평가하기 위해 스위스 롤링 및 면역 염색 기술의 조합을 사용하여 설명합니다.

Introduction

심장병과 뇌졸중을 포함한 심장 대사 장애는 전 세계 주요 사망 원인입니다1. 신체 활동 부족, 영양 부족, 노화 및 유전학은 이러한 장애의 병태생리학을 조절합니다. 축적된 증거는 장내 미생물군이 제2형 당뇨병2, 비만3, 고혈압4을 포함한 심혈관 및 대사 장애에 영향을 미친다는 개념을 뒷받침하며, 이는 이러한 질병에 대한 새로운 치료법 개발의 열쇠가 될 수 있습니다.

미생물군이 질병을 일으키는 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며, 부분적으로는 방법론적 차이로 인해 현재 연구는 매우 다양합니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. FMT는 표현형을 유도하거나 억제하기 위해 동물 연구에서 널리 사용됩니다. 예를 들어, 칼로리 섭취 및 포도당 대사는 배설물을 아픈 기증자로부터 건강한 수혜자에게 전달함으로써 조절될 수 있다 5,6. 인간의 경우, FMT는 클로스트리디움 디피실 감염이 재발하는 환자에게 안전한 치료 옵션인 것으로 나타났다7. 심혈관 질환 관리에 대한 사용을 뒷받침하는 증거가 나타나고 있습니다. 예를 들어, 희박한 대사 증후군 환자에서 FMT는 인슐린 감수성을 개선한다8. 장내 dysbiosis는 또한 인간 및 설치류 연구모두에서 고혈압과 관련이 있습니다 9,10,11. 무균 생쥐에 고염식을 먹인 생쥐의 FMT는 수혜자가 염증과 고혈압에 걸리기 쉽다12.

설치류에서 FMT 성공률이 높음에도 불구하고 번역 문제는 여전히 남아 있습니다. 비만과 대사증후군을 치료하기 위해 FMT를 사용한 임상 시험은 이러한 장애에 대한 영향이 미미하거나 전혀 없음을 나타냅니다13,14,15. 따라서 심장 대사 장애 치료를 위해 장내 미생물군을 표적으로 하는 추가 치료 방법을 식별하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 장내 미생물군과 심혈관 질환에 대한 이용 가능한 증거의 대부분은 연관성이 있습니다. 설명된 프로토콜은 질병과 장내 미생물군 사이의 연관성을 보여주고 장내 모든 부분의 무결성을 직접 평가하기 위해 FMT와 스위스 롤링 기술의 조합을 활용하는 방법에 대해 논의합니다16,17,18.

이 방법의 전반적인 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하기 위한 지침을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 생리학적 번역을 촉진하고 결과의 엄격함과 재현성을 높이기 위해 실험 설계에서 더 많은 세부 사항과 주요 고려 사항을 제공합니다.

Protocol

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이 원고에 설명된 모든 절차를 승인했습니다. 생후 3개월의 C57B1/6 수컷 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입하여 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 사육하고 관리했습니다. 1. 인간 배설물 샘플의 수집, 저장 및 처리 피험자가 클리닉에 있는 경우 멸…

Representative Results

위에서 설명한 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 마우스 맹장 내용물 또는 인간 배설물을 멸균 식염수에 재현탁하여 먼저 연속 3일 동안, 그 다음 3일에 한 번씩 위관영양법으로 무균 마우스(100μL)에게 제공할 슬러리를 제조합니다. 프로토콜이 끝나면 꼬리 커프 방법으로 혈압을 측정하고 마우스를 안락사시키고 조직을 채취하여 장내 미생물총의 변화와 심혈관 및 대사 ?…

Discussion

심혈관 및 대사 질환에서 장내 미생물총의 인과적 역할을 연구하는 귀중한 접근 방식은 전체 미생물군 또는 선별된 관심 종을 무균 마우스로 옮기는 것입니다. 여기에서 우리는 고혈압 장애에서 장내 미생물총의 역할을 연구하기 위해 인간과 전통적으로 수용된 쥐의 배설물 샘플을 무균 생쥐로 수집하는 프로토콜을 설명합니다.

생쥐에서는 호기성실에서 처리 된 무균 수집 ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 National Center for Advancing Translational Sciences의 Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243(to A.K.)의 지원을 받았습니다. 미국 심장 협회 보조금 POST903428 (JAI에); 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소는 K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941(AK로) 보조금을 부여하고 NIH는 1P01HL116263(VK로)을 부여합니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.

Materials

Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost ThermoFisher B40932
Anaerobic chamber COY 7150220
Apolipoprotein AI Novus Biologicals NBP2-52979
Artery Scissors – Ball Tip Fine Science Tools 14086-09
Bleach solution Fisher Scientific 14-412-53
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific B14
CD3 antibody ThermoFisher  14-0032-82
CD68 monoclonal antibody ThermoFisher 14-0681-82
Centrifuge Fisher Scientific 75-004-221
CODA high throughput monitor Kent Scientic Corporation CODA-HT8
Cryogenic vials Fisher Scientific 10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes Fisher Scientific 137119AM
Disposable syringes Fisher Scientific 14-823-2A
Ethanol Fisher Scientific AA33361M1
Feeding Needle Fine Science Tools 18061-38
Filter (30 µm) Fisher Scientific NC0922459
Filter paper sheet Fisher Scientific 09-802
Formalin (10%) Fisher Scientific 23-730-581
High salt diet Teklad TD.03142
OMNIgene.GUT DNAgenotek OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps Alzet  MODEL 2002
PAP Pen Millipore Sigma Z377821-1EA
Petri dish Fisher Scientific AS4050
Pipette tips Fisher Scientific 21-236-18C
Pipettes Fisher Scientific 14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline Fisher Scientific AAJ61196AP
Smart spatula Fisher Scientific NC0133733
Stool collection device Fisher Scientific 50-203-7255
TBS Buffer Fisher Scientific R017R.0000
Triton X-100 Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix platform rocker Fisher Scientific 09047113Q
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-41
Xylene Fisher Scientific 1330-20-7, 100-41-4
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Referenzen

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Ishimwe, J. A., Zhong, J., Kon, V., Kirabo, A. Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation. J. Vis. Exp. (195), e64310, doi:10.3791/64310 (2023).
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