FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

Summary

Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.

Abstract

Een groeiend aantal bewijzen toont aan dat B-lymfocyten een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale aanpassing aan letsel. De literatuur rapporteert echter contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Van B-cellen is gemeld dat ze zowel tot de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart behoren als aanwezig zijn, maar met een aanzienlijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen, of vrij zeldzaam zijn. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocardium. Implementatie van een gedeelde, reproduceerbare methode om de prevalentie van myocardiale B-cellen te beoordelen, is van cruciaal belang om waarnemingen van verschillende onderzoeksgroepen te harmoniseren en zo de voortgang van de studie van B-cel myocardiale interacties te bevorderen. Op basis van onze ervaring komen de schijnbaar contrasterende waarnemingen die in de literatuur worden gerapporteerd waarschijnlijk voort uit het feit dat muizenmyocardiale B-cellen meestal intravasculair zijn en verbonden met het microvasculaire endotheel. Daarom is het aantal B-cellen dat wordt teruggewonnen uit een muizenhart buitengewoon gevoelig voor de perfusieomstandigheden die worden gebruikt om het orgaan te reinigen en voor de gebruikte verteringsmethode. Hier rapporteren we een geoptimaliseerd protocol dat op een specifieke manier rekening houdt met deze twee kritieke variabelen. Dit protocol maakt reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde analyse van het aantal muizenmyocardiale B-cellen mogelijk en stelt onderzoekers in staat om extravasculaire versus intravasculaire myocardiale B-cellen te onderscheiden.

Introduction

B-lymfocyten zijn zeer gespecialiseerde immuuncellen die een belangrijke rol spelen in zowel adaptieve als aangeboren immuunresponsen¹. Er zijn twee hoofdpopulaties van B-cellen: een kleinere populatie van B1-cellen die meestal worden geproduceerd tijdens het embryonale leven, en een overheersende populatie van B2-cellen die in het volwassen leven in het beenmerg worden geproduceerd¹. Na rijping in het beenmerg migreren B-cellen naar primaire en secundaire lymfoïde organen. Van daaruit recirculeren ze continu tussen lymfoïde organen die door bloedvaten en lymfevaten reizen². B-cellen brengen specifieke antilichamen tot expressie op hun oppervlak, die functioneren als receptoren. Wanneer B-cellen een antigeen tegenkomen dat zich aan hun receptor bindt, kan een activerend signaal worden geactiveerd. Geactiveerde B-cellen migreren naar het weefsel waar het antigeen werd gevonden of gaan terug naar het beenmerg waar ze kunnen rijpen tot antilichaamproducerende plasmacellen ^3,4.

Onlangs is het gewaardeerd dat het hart een aanzienlijke populatie B-cellen herbergt. Studies bij knaagdieren hebben aangetoond dat B-cellen het hart vroeg koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling⁵, en dat myocardiale geassocieerde B-cellen meestal intravasculaire, naïeve B2-cellen zijn die zich hechten aan het endotheel ^6,7, met een klein percentage B1-cellen⁷. Er zijn nog veel gebieden van onzekerheid, maar de beschikbare gegevens geven aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen, zowel in het naïeve hart als in de context van myocardiale aanpassing aan letsel.

Studies in het naïeve muizenhart hebben aangetoond dat bij baseline myocardiale B-cellen zich meestal in de intravasculaire ruimte bevinden, gehecht aan het endotheel (>95% van de murine cardiale B-cellen bleken zich in de intravasculaire ruimte te bevinden). Deze B-cellen bleken genexpressiepatronen te hebben die verschillen van die van circulerende B-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed. Analyse van naïeve harten van B-cel-deficiënte dieren en syngene controles wees uit dat dieren zonder B-cellen kleinere harten en hogere ejectiefractie⁶ hadden. Al dit bewijs suggereert dat B-cellen de myocardiale groei en/of myocardiale functie kunnen moduleren, en dat niet alleen interstitiële maar ook intravasculaire B-cellen verantwoordelijk kunnen zijn voor dergelijke waarnemingen. B-cellen bleken ook het fenotype van myocardiale residente macrofagen te moduleren⁸.

Verschillende studies hebben aangetoond dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale aanpassing aan letsel 8,9,10,11,12,13. B-cellen hopen zich tijdelijk op in het gewonde hart, waarschijnlijk via een CXCL13-CXCR5-afhankelijk mechanisme^11,13. Van daaruit bevorderen B-cellen nadelige cardiale remodellering via verschillende mechanismen, waaronder cytokine-gemedieerde monocytenrekrutering ^9,12. Bovendien kunnen B-cellen antilichamen tegen harteiwitten produceren die de uitbreiding van hartschade en ongunstige hartremodellering kunnen bevorderen via verschillende mechanismen 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-cellen kunnen ook beschermende effecten uitoefenen op het gewonde hart door de afscheiding van IL-10¹⁰.

Naarmate het aantal groepen dat de rol van B-cellen in het naïeve en gewonde hart onderzoekt, groeit, wordt het steeds belangrijker om gedeelde protocollen te definiëren om myocardiale B-cellen goed te kwantificeren en te beoordelen en zo inconsistenties te voorkomen die al in de literatuur zijn begonnen te verschijnen. Tot nu toe zijn B-cellen in feite beide gemeld als een van de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart⁷ en aanwezig te zijn met een duidelijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen^26,27, of vrij zeldzaam²⁸. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct ^7,9,13, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocard²⁹. Studies op cardiale immuuncellen geven zelden details over perfusieomstandigheden en er is geen consensus over de spijsverteringscondities. Aangezien in het knaagdierhart een groot deel van de B-cellen intravasculair is en de extractie van immuuncellen uit het myocard sterk afhankelijk is van de gebruikte verteringsmethode, kunnen de in de literatuur gemelde verschillen het gevolg zijn van verschillen in orgaanperfusie en weefselvertering.

Hier gepresenteerd is een gedetailleerde methode voor flowcytometrie-gebaseerde kwantificering van murine myocardiale B-cellen die de opbrengst van B-celherstel maximaliseert door perfusie- en spijsverteringscondities te optimaliseren en de discriminatie van intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellen^{mogelijk maakt 6}. Dit protocol is een aanpassing en optimalisatie van andere vergelijkbare protocollen die onderscheid maken tussen intravasculaire en interstitiële immuuncellen 28,30,31.

In dit protocol standaardiseren we myocardiale perfusie om B-cellen die in de intravasculaire ruimte zweven te elimineren zonder biologisch relevante B-cellen te verwijderen die aan het microvasculaire endotheel zijn gehecht. Bovendien, voortbouwend op eerdere protocollen die het gebruik van intraveneuze injectie van antilichamen hebben beschreven om intravasculaire van interstitiële immuuncellen te onderscheiden³², en gebruikmakend van het feit dat B-cellen de oppervlaktemarker B220³³ tot expressie brengen, demonstreren we hoe intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellen kunnen worden onderscheiden door intravasculaire injectie van een B220-specifiek antilichaam onmiddellijk vóór het dierenoffer en de hartperfusie. Dit protocol is relevant voor het onderzoek van elke wetenschapper die geïnteresseerd is in het opnemen van de analyse van myocardiale B-cellen in het naïeve en gewonde hart. De wijdverspreide implementatie van dit protocol zal inconsistenties tussen onderzoeksgroepen verminderen, zal de analyse van veranderingen in de intravasculaire en extravasculaire myocardiale B-celpools mogelijk maken en zo de vooruitgang van ontdekkingen op het gebied van cardiale immunologie ondersteunen.

Samenvattend vertegenwoordigt het protocol een geoptimaliseerde workflow om myocardiale B-cellen te kwantificeren en te analyseren via flowcytometrie, en tegelijkertijd onderscheid te maken tussen cellen in de extravasculaire ruimte en de intravasculaire ruimte.

Protocol

Alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven, werden uitgevoerd met de goedkeuring van de IACUC aan de Johns Hopkins University School of Medicine. 1. Voorbereidingen Bereid de FACS-buffer voor, zoals beschreven in tabel 1. Zorg voor voldoende CO2 om de dieren te euthanaseren. Bereid de snijruimte voor (plaats het bankkussen en plaats de tape en snijgereedschappen in de buurt). Label de 15 ml buis…

Representative Results

Zodra de acquisitie is voltooid en alle gebeurtenissen zijn verzameld, moeten de gegevens worden geanalyseerd volgens de standaard flowcytometriepraktijk. De focus van de analyse zal variëren afhankelijk van het individuele doel van elk experiment. In dit geval werd kwantificering van intravasculaire en extravasculaire B-cellen nagestreefd en werd deze uitgedrukt als het aantal cellen per mg weefsel. Bij gebruik van een spectrale cytometer wordt aanbevolen om de analyse te starten met een eer…

Discussion

Een groeiend aantal aanwijzingen geeft aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale remodellering / aanpassing aan letsel 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometrie is een uitstekend hulpmiddel om immuuncelpo…

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I – 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend