フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)
Summary
ここでは、フローサイトメトリーを用いた血管内または内皮腔内の位置に基づく心筋Bリンパ球の定量と分化のためのプロトコルを報告します。
Abstract
Bリンパ球が心筋生理学および傷害への心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示す証拠が増えています。しかし、文献は心筋B細胞の有病率に関する対照的なデータを報告しています。B細胞は、げっ歯類の心臓で最も一般的な免疫細胞の中にあるか、存在すると報告されていますが、骨髄系細胞よりも有病率が著しく低いか、非常にまれです。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載しているが、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化がないことを報告した。心筋B細胞の有病率を評価するための共有された再現可能な方法の実装は、さまざまな研究グループからの観察を調和させ、B細胞心筋相互作用の研究の進歩を促進するために重要です。私たちの経験に基づくと、文献で報告されている一見対照的な観察結果は、マウス心筋B細胞がほとんど血管内であり、微小血管内皮に接続されているという事実に由来する可能性があります。したがって、マウス心臓から回収されるB細胞の数は、臓器をきれいにするために使用される灌流条件と使用される消化方法に非常に敏感です。ここでは、これら2つの重要な変数を特定の方法で説明する最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、マウス心筋B細胞の数の再現性のあるフローサイトメトリーベースの分析を可能にし、研究者が血管外心筋B細胞と血管内心筋B細胞を区別することを可能にします。
Introduction
Bリンパ球は高度に特殊化された免疫細胞であり、適応免疫応答と自然免疫応答の両方に重要な役割を果たしています1。B細胞には2つの主要な集団があります:主に胚期に産生されるB1細胞のより小さな集団と、骨髄1で成人期に産生されるB2細胞の優勢集団です。骨髄で成熟した後、B細胞は一次および二次リンパ器官に移動します。そこから、血管とリンパ管を通過するリンパ器官の間を継続的に再循環します2。B細胞は、受容体として機能する特異的抗体を表面に発現します。B細胞が受容体に結合する抗原に遭遇すると、活性化シグナルがトリガーされる可能性があります。活性化されたB細胞は、抗原が発見された組織に移動するか、骨髄に戻り、そこで抗体産生形質細胞に成熟することができます3,4。
最近、心臓にはかなりの数のB細胞が宿っていることが評価されています。げっ歯類の研究は、B細胞が胚発生の早い段階で心臓にコロニーを形成することを示しており5、心筋関連B細胞は主に血管内のナイーブなB2細胞であり、内皮に接着しており6,7、B1細胞の割合はわずかです7。不確実性の領域はまだたくさんありますが、入手可能なデータは、B細胞がナイーブ心臓と損傷への心筋適応の文脈の両方で重要な役割を果たすことを示しています。
ナイーブマウス心臓での研究では、ベースライン時に心筋B細胞が主に血管内腔に位置し、内皮に接着していることが示されています(マウス心臓B細胞の>95%が血管内腔にあることがわかりました)。これらのB細胞は、末梢血から単離された循環B細胞のものとは異なる遺伝子発現パターンを有することがわかった。B細胞欠損動物および同系対照からのナイーブ心臓の分析は、B細胞を欠く動物がより小さく、駆出率が高いことを発見しました6。これらすべての証拠は、B細胞が心筋の成長および/または心筋機能を調節する可能性があり、間質性だけでなく血管内のB細胞もそのような観察の原因である可能性があることを示唆しています。B細胞は、心筋常在マクロファージの表現型を調節することも見出された8。
いくつかの研究は、B細胞が損傷に対する心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示している8、9、10、11、12、13。B細胞は、おそらくCXCL13-CXCR5依存性機構を介して、損傷した心臓に一過性に蓄積する11,13。そこから、B細胞は、サイトカインを介した単球の動員を含むいくつかのメカニズムを通じて、有害な心臓リモデリングを促進します9,12。さらに、B細胞は、いくつかのメカニズムを介して心臓損傷の拡張および有害な心臓リモデリングを促進することができる心臓タンパク質に対する抗体を産生することができる14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25.B細胞はまた、IL-1010の分泌を介して損傷した心臓に保護効果を発揮することができる。
ナイーブで負傷した心臓におけるB細胞の役割を調査するグループの数が増えるにつれて、心筋B細胞を適切に定量および評価し、すでに文献に現れ始めている矛盾を回避するための共有プロトコルを定義することがますます重要になっています。これまでのところ、B細胞は実際にげっ歯類の心臓7で最も一般的な免疫細胞の1つであり、骨髄系細胞よりも著しく低い有病率で存在すると報告されています26,27、または非常にまれです28。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載している7,9,13が、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化を報告しなかった29。心臓免疫細胞の研究では、灌流条件の詳細が説明されることはめったになく、消化条件に関するコンセンサスはありません。げっ歯類の心臓ではB細胞の大部分が血管内であり、心筋からの免疫細胞の抽出は使用する消化方法に大きく依存するため、文献で報告されている違いは臓器灌流と組織消化の違いの結果である可能性があります。
ここでは、灌流および消化条件を最適化することでB細胞回収の収率を最大化し、血管内心筋B細胞と血管外心筋B細胞の識別を可能にする、マウス心筋B細胞のフローサイトメトリーベースの定量の詳細な方法を示します6。このプロトコルは、血管内免疫細胞と間質免疫細胞とを区別する他の類似のプロトコルの適応および最適化である28、30、31。
このプロトコルでは、心筋灌流を標準化して、微小血管内皮に接着した生物学的に関連するB細胞を除去することなく、血管内空間に浮遊するB細胞を排除します。さらに、血管内免疫細胞と間質免疫細胞を区別するための抗体の静脈内注射の使用を説明した以前のプロトコルに基づいて32、B細胞が表面マーカーB220を発現するという事実を利用して33、動物の犠牲および心臓灌流の直前にB220特異的抗体の血管内注射を通じて血管内心筋B細胞を区別する方法を示します。このプロトコルは、ナイーブで負傷した心臓の心筋B細胞の分析を含めることに関心のある科学者の研究に関連しています。このプロトコルの広範な実装は、研究グループ間の不一致を減らし、血管内および血管外の心筋B細胞プールの変化の分析を可能にし、したがって心臓免疫学の分野における発見の進歩を強化します。
要約すると、このプロトコルは、フローサイトメトリーを介して心筋B細胞を定量および分析すると同時に、血管外空間と血管内空間に位置する細胞を区別するための最適化されたワークフローを表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ますます多くの証拠が、B細胞が心筋生理学および心筋のリモデリング/損傷への適応の文脈で重要な役割を果たすことを示しています7、8、9、10、11、12、13、36。フローサイトメトリーは、あ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ルイジ・アダモに授与されたNHLBI助成金5K08HLO145108-03および1R01HL160716-01によって資金提供されました。
この研究の開発に使用されたオーロラフローサイトメーターは、NIHグラントS10OD026859によって資金提供されました。JHUロスフローサイトメトリーコアのサポートに感謝します。
Materials
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
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