Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae
Summary
Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.
Abstract
Die eukaryotische DNA-Replikation ist ein stark regulierter Prozess, der sicherstellt, dass der genetische Bauplan einer Zelle vor der Chromosomentrennung korrekt dupliziert wird. Da DNA-Synthesedefekte Chromosomenumlagerungen zugrunde liegen, ist die Überwachung der DNA-Replikation unerlässlich geworden, um die Grundlagen der Genominstabilität zu verstehen. Saccharomyces cerevisiae ist ein klassisches Modell zur Untersuchung der Zellzyklusregulation, aber wichtige DNA-Replikationsparameter, wie der Anteil der Zellen in der S-Phase oder die S-Phasendauer, sind immer noch schwer zu bestimmen. Dieses Protokoll verwendet kurze und ungiftige Impulse von 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU), einem Thymidinanalogon, in technisch hergestellten TK-hENT1-Hefezellen, gefolgt von seiner Detektion durch Click-Reaktion, um die Visualisierung und Quantifizierung der DNA-Replikation mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Diese Methode kann zuvor übersehene Defekte in der S-Phase und im Zellzyklusverlauf von Hefemutanten identifizieren und so die Charakterisierung neuer Akteure ermöglichen, die für die Gewährleistung der Genomstabilität unerlässlich sind.
Introduction
Die Genomstabilität durch mitotische Teilung wird durch die Übertragung eines vollständigen und gleichen Chromosomensatzes auf die beiden produzierten Zellnachkommen gewährleistet. Dies beruht auf der genauen Fertigstellung einer Reihe von Ereignissen, die in einer bestimmten Zeit in jeder Phase des Zellzyklus auftreten. In G 1 werden die Replikationsursprünge nach der Rekrutierung mehrerer Lizenzfaktoren, einschließlich Cdc61, lizenziert. In der S-Phase wird die Duplikation des gesamten Genoms von mehreren aktiven Replikationsursprüngen initiiert und von Replikationsmaschinen durchgeführt, die sich in mikroskopisch sichtbaren Herden sammeln, die als Replikationsfabrikenbezeichnet werden 2. In der M-Phase werden duplizierte Schwesterchromatiden an der mitotischen Spindel befestigt und biorientiert, um ihre Segregation zu den entgegengesetzten Polen der mitotischen Zelle3 zu ermöglichen. Die Regulierung, der ordnungsgemäße Abschluss und die Dauer jeder Phase sind der Schlüssel zur Gewährleistung der Genomstabilität. Tatsächlich führt ein vorzeitiger Ausstieg aus einer dieser Phasen zu einer Instabilität des Genoms. Zum Beispiel wird ein kürzeres G1, das durch Deletion des knospenden Hefe-CDK-Inhibitors Sic1 oder durch die Überexpression vonG1-Cyclinen induziert wird, die nachfolgende S-Phase 4,5,6 verändern. Folglich führen diese Deregulierungen, die mit Replikationsstress verbunden sind oder nicht, zu Chromosomenbrüchen, Umlagerungen und Fehltrennungen 4,5,6. Daher kann die Überwachung der Dauer der S-Phase und allgemeiner der Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus entscheidend sein, um die Defekte zu identifizieren, die in verschiedenen Mutanten und unter verschiedenen Stressbedingungen auftreten.
Eine traditionelle Methode zur Messung der Zellzyklusphasendauer umfasst die einfache DNA-Inhaltsdurchflusszytometrie (Abbildung 1A) und basiert auf einem geeigneten Algorithmus (verfügbar in den meisten Zytometrie-Software), der verwendet wird, um die Population in G1, S und G2 + M-Phasenfraktionen von den 1C- und 2C-Peaks zu trennen. Die Brüche werden dann mit der Populationsverdopplungszeit7 multipliziert. Diese Methode liefert jedoch nur geschätzte Werte, erfordert eine homogene Zellgrößenverteilung innerhalb eines gegebenen Bruchteils und ist nicht auf synchronisierte Kulturen anwendbar. Um die S-Phasendauer in Säugetierzellen zu untersuchen, wurden mehrere Thymidinanaloga entwickelt und weit verbreitet, einschließlich EdU. Ihre Aufnahme aus dem extrazellulären Medium und die Phosphorylierung durch Thymidinkinase (im Folgenden als TK bezeichnet) machen sie für DNA-Polymerasen verfügbar, um sie an Orten der DNA-Synthese (Replikation, Rekombination, Reparatur) einzubauen. Um das Fehlen des TK-Gens in Saccharomyces cerevisiae-Zellen zu umgehen, wurden Hefestämme so entwickelt, dass sie eine stabile und konstitutive Expression des Herpes-simplex-Virus TK8 und des humanen equilibrativen Nukleosidtransporters (hENT1)9 ermöglichen. Einmal in die DNA eingebaut, wird EdU durch die selektive Click-Reaktion nachgewiesen, die seinen Alkinanteil chemisch an azidmodifizierte Fluorochrome10 koppelt.
Dieser Artikel bietet zwei optimierte umfassende Protokolle zur Pulsmarkierung asynchroner und synchroner TK-hENT1-Zellen mit EdU, um die Dauer und Dynamik der DNA-Replikation sowie die Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie präzise zu visualisieren und zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hefe ist ein erstklassiger Modellorganismus für Zellzyklusstudien, aber die Charakterisierung seiner S-Phase wurde lange Zeit durch seine Unfähigkeit behindert, exogene Nukleoside wie BrdU aufzunehmen, die als Tracer der DNA-Replikation verwendet werden. Die Ausstattung der Hefe mit einer hohen Expression von Herpes-simplex-Thymidinkinase (TK) und die Zugabe eines humanen Nukleosidtransporters (hENT) hat dieses Problem weitgehend gelöst15,16. EdU ist vielseiti…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Agence Nationale de la Recherche (ANR) und der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) für die PhD-Stipendien an J.d.D.B.T. und der Agence Nationale pour la Recherche (ANR) für die finanzielle Unterstützung (Stipendium ANR-18-CE12-0018-01). Zytometrie und Mikroskopie wurden in der Montpellier MRI BioCampus Bildgebungsanlage durchgeführt.
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
Referenzen
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetik. 196 (1), 31-63 (2014).
- Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
- Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
- Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
- Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
- McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
- Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
- Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
- Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
- Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
- Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
- Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
- Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
- Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).
