קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae
Summary
אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ”א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.
Abstract
שכפול DNA אאוקריוטי הוא תהליך מוסדר מאוד המבטיח כי התוכנית הגנטית של התא משוכפלת כראוי לפני הפרדת הכרומוזומים. מכיוון שפגמים בסינתזת דנ”א עומדים בבסיס סידור מחדש של כרומוזומים, ניטור שכפול הדנ”א הפך לחיוני להבנת הבסיס לחוסר יציבות הגנום. Saccharomyces cerevisiae הוא מודל קלאסי לחקר ויסות מחזור התא, אך עדיין קשה לקבוע פרמטרים מרכזיים של שכפול DNA, כגון חלק התאים בשלב S או משך שלב S. פרוטוקול זה משתמש בפולסים קצרים ולא רעילים של 5-אתיניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), אנלוגי של תימידין, בתאי שמרים מהונדסים מסוג TK-hENT1, ולאחר מכן זיהויו על ידי תגובת קליק כדי לאפשר הדמיה וכימות של שכפול DNA ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה. שיטה זו עשויה לזהות פגמים שהתעלמו מהם בעבר בשלב S ובהתקדמות מחזור התא של מוטנטים של שמרים, ובכך לאפשר אפיון של שחקנים חדשים החיוניים להבטחת יציבות הגנום.
Introduction
יציבות הגנום באמצעות חלוקה מיטוטית מובטחת על ידי העברת קבוצה שלמה ושווה של כרומוזומים לשני אבות התאים המיוצרים. זה מסתמך על השלמה מדויקת של סדרה של אירועים המתרחשים בזמן נתון בכל שלב של מחזור התא. ב- G 1, מקורות השכפול מורשים עם גיוסם של מספר גורמי רישוי, כולל Cdc61. בשלב S, שכפול גנום שלם מתחיל ממקורות שכפול פעילים מרובים ומבוצע על ידי מכונות שכפול המתאספות במוקדים הנראים לעין מיקרוסקופית בשם מפעלי שכפול2. בשלב M, כרומטידים אחיות משוכפלים מחוברים ודו-כיווניים על הציר המיטוטי כדי לאפשר את הפרדתם לקטבים המנוגדים של התא המיטוטי3. הרגולציה, ההשלמה הנכונה ומשך הזמן של כל שלב הם המפתח להבטחת יציבות הגנום. ואכן, יציאה מוקדמת מכל אחד מהשלבים הללו מובילה לחוסר יציבות גנומית. לדוגמה, G 1 קצר יותר המושרה על ידי מחיקה של מעכב CDK שמרים ניצנים Sic1 או על ידי ביטוי יתר של ציקלינים G1 ישנה את שלב Sהבא 4,5,6. כתוצאה מכך, הסרת הרגולציה הזו, הקשורה או לא ללחץ שכפול, גורמת לשברים בכרומוזומים, לסידור מחדש ולהפרדה שגויה 4,5,6. לכן, ניטור משך שלב S, ובאופן רחב יותר, משך השלבים האחרים של מחזור התא עשוי להיות חיוני כדי לזהות את הפגמים המתרחשים במוטציות שונות ובתנאי עקה שונים.
שיטה מסורתית למדידת משך הפאזה של מחזור התא כוללת ציטומטריה פשוטה של זרימת תוכן DNA (איור 1A) ומסתמכת על אלגוריתם מתאים (זמין ברוב תוכנות הציטומטריה) המשמש להפרדת האוכלוסייה לשברי פאזה G1, S ו- G2 + M מהפסגות 1C ו- 2C. לאחר מכן השברים מוכפלים בזמן הכפלת האוכלוסייה7. עם זאת, שיטה זו נותנת רק ערכים משוערים, דורשת התפלגות גודל תא הומוגנית בתוך שבר נתון, ואינה ישימה לתרביות מסונכרנות. כדי לחקור את משך שלב ה-S בתאי יונקים, פותחו מספר אנלוגים של תימידין ונעשה בהם שימוש נרחב, כולל EdU. ספיגתם מהמדיום החוץ-תאי והזרחון על ידי תימידין קינאז (להלן TK) הופכים אותם לזמינים עבור פולימראזות DNA כדי לשלב אותם באתרים של סינתזת DNA (שכפול, רקומבינציה, תיקון). כדי לעקוף את היעדר הגן TK בתאי Saccharomyces cerevisiae, הונדסו זני שמרים כדי לאפשר ביטוי יציב ומכונן של נגיף ההרפס סימפלקס TK8 וטרנספורטר נוקלאוזיד שיווי משקל אנושי (hENT1)9. לאחר ששולב בדנ”א, EdU מזוהה באמצעות תגובת קליק סלקטיבית, אשר מצמידה כימית את מואטיות האלקין שלו לפלואורוכרומים10 שעברו שינוי אזיד.
מאמר זה מספק שני פרוטוקולים מקיפים ממוטבים לתיוג פולסים של תאים מהונדסים אסינכרוניים וסינכרוניים מסוג TK-hENT1 עם EdU על מנת להמחיש ולמדוד במדויק את משך ודינמיקת שכפול הדנ”א, כמו גם את משך השלבים האחרים של מחזור התא, עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שמרים הם אורגניזם מודל ראשוני לחקר מחזור התא, אך האפיון של שלב ה-S שלו נפגע זה מכבר בשל חוסר יכולתו לשלב נוקלאוזידים אקסוגניים, כגון BrdU, המשמשים כעקבות של שכפול DNA. הצטיידות שמרים בביטוי גבוה של הרפס סימפלקס תימידין קינאז (TK) ותוספת של טרנספורטר נוקלאוזיד אנושי (hENT) פתרו במידה רבה את הבעיה הזו…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לסוכנות הלאומית דה לה רשרש (ANR) ולאגודה לסרטן (ARC) על מלגות הדוקטורט ל- J.d.D.B.T. ול- Agence Nationale pour la Recherche (ANR) לתמיכה כספית (מענק ANR-18-CE12-0018-01). ציטומטריה ומיקרוסקופיה בוצעו במתקן ההדמיה BioCampus MRI במונפלייה.
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
Referenzen
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetik. 196 (1), 31-63 (2014).
- Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
- Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
- Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
- Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
- McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
- Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
- Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
- Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
- Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
- Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
- Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
- Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
- Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).
