Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Summary

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Abstract

A replicação do DNA eucariótico é um processo altamente regulado que garante que o modelo genético de uma célula seja corretamente duplicado antes da segregação cromossômica. Como os defeitos de síntese de DNA estão subjacentes aos rearranjos cromossômicos, o monitoramento da replicação do DNA tornou-se essencial para entender a base da instabilidade do genoma. Saccharomyces cerevisiae é um modelo clássico para estudar a regulação do ciclo celular, mas os principais parâmetros de replicação do DNA, como a fração de células na fase S ou a duração da fase S, ainda são difíceis de determinar. Este protocolo utiliza pulsos curtos e não tóxicos de 5-etil-2′-desoxiuridina (EdU), um análogo da timidina, em células de levedura TK-hENT1 modificadas, seguidas de sua detecção por reação Click para permitir a visualização e quantificação da replicação do DNA com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo. Este método pode identificar defeitos anteriormente negligenciados na fase S e na progressão do ciclo celular de mutantes de levedura, permitindo assim a caracterização de novos players essenciais para garantir a estabilidade do genoma.

Introduction

A estabilidade do genoma através da divisão mitótica é assegurada pela transmissão de um conjunto completo e igual de cromossomos para as duas progênies celulares produzidas. Isso depende da conclusão precisa de uma série de eventos que ocorrem em um determinado tempo em cada fase do ciclo celular. No G 1, as origens de replicação são licenciadas mediante o recrutamento de vários fatores de licenciamento, incluindo o Cdc6₁. Na fase S, a duplicação do genoma inteiro é iniciada a partir de múltiplas origens de replicação ativas e executada por máquinas de replicação que se reúnem em focos microscopicamente visíveis chamados fábricas de replicação². Na fase M, cromátides irmãs duplicadas são anexadas e biorientadas no fuso mitótico para permitir sua segregação para os polos opostos da célula mitótica³. A regulação, a conclusão adequada e a duração de cada fase são fundamentais para garantir a estabilidade do genoma. De fato, a saída prematura de qualquer uma dessas fases leva à instabilidade do genoma. Por exemplo, um G1 mais curto induzido pela deleção do inibidor de CDK de levedura em brotamento_Sic1 ou pela superexpressão de ciclinas G₁ alterará a fase S^{subsequente 4,5,6}. Consequentemente, essas desregulamentações, associadas ou não à tensão de replicação, resultam em quebras cromossômicas, rearranjos e má segregação ^4,5,6. Portanto, monitorar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração das outras fases do ciclo celular pode ser crucial para identificar os defeitos que ocorrem em diferentes mutantes e em diferentes condições estressantes.

Um método tradicional para medir a duração da fase do ciclo celular inclui citometria de fluxo de conteúdo de DNA simples (Figura 1A) e depende de um algoritmo de ajuste (disponível na maioria dos softwares de citometria) usado para separar a população em frações de fase G₁, S e G₂ + M dos picos 1C e 2C. As frações são então multiplicadas pelo tempo de duplicação da população⁷. No entanto, este método fornece apenas valores estimados, requer uma distribuição homogênea do tamanho da célula dentro de uma determinada fração e não é aplicável a culturas sincronizadas. Para estudar a duração da fase S em células de mamíferos, vários análogos da timidina foram desenvolvidos e amplamente utilizados, incluindo o EdU. Sua absorção do meio extracelular e fosforilação pela timidina quinase (doravante referida como TK) os tornam disponíveis para DNA polimerases para incorporá-los em locais de síntese de DNA (replicação, recombinação, reparo). Para contornar a ausência do gene TK nas células de Saccharomyces cerevisiae , cepas de levedura foram modificadas para permitir a expressão estável e constitutiva do vírus herpes simplex TK⁸ e do transportador de nucleosídeos equilibrados humanos (hENT1)⁹. Uma vez incorporado ao DNA, o EdU é detectado através da reação seletiva de Click, que acopla quimicamente sua porção alquina a fluorocromos modificados com azida¹⁰.

Este artigo fornece dois protocolos abrangentes otimizados para células de engenharia assíncronas e síncronas de TK-hENT1 com EdU, a fim de visualizar e medir com precisão a duração e a dinâmica da replicação do DNA, bem como a duração das outras fases do ciclo celular, com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo.

Protocol

1. Cultura de células de S. cerevisiae NOTA: As estirpes de levedura utilizadas estão listadas no quadro 1 NOTA: A duração da fase S pode ser monitorada de diferentes maneiras. Dependendo da questão a ser abordada, as células podem ser cultivadas de forma assíncrona ou síncrona após a parada do G1 . De células de S. cerevisiae de crescimento assíncronoNOTA: Este método permite a…

Representative Results

Para determinar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração de G 1 e G2 + M (etapa do protocolo 1.1), células selvagens do tipo S. cerevisiae W303 (WT, Tabela 1) foram cultivadas de forma assíncrona em meio SC por 7 h. A cada hora, a concentração celular foi monitorada para determinar o tempo de duplicação (Figura 2B). Nessas condições de crescimento, o tempo de duplicação calculado foi de 120 min ± 13 min a 25 °C (<st…

Discussion

A levedura é um organismo modelo primordial para estudos do ciclo celular, mas a caracterização de sua fase S tem sido dificultada por sua incapacidade de incorporar nucleosídeos exógenos, como o BrdU, que são usados como traçadores da replicação do DNA. Equipar leveduras com alta expressão de herpes simplex timidina quinase (TK) e a adição de um transportador de nucleosídeos humanos (hENT) resolveram em grande parte esse problema^15,16. O EdU é mais…

Materials

α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100–812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent