Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging
Summary
Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.
Abstract
Organoïden zijn een betrouwbare methode voor het modelleren van orgaanweefsel vanwege hun zelforganiserende eigenschappen en behoud van functie en architectuur na voortplanting uit primair weefsel of stamcellen. Deze methode van organoïde generatie ziet af van eencellige differentiatie door meerdere passages en gebruikt in plaats daarvan differentiële centrifugatie om borstepitheelorganoïden te isoleren van mechanisch en enzymatisch gedissocieerde weefsels. Dit protocol biedt een gestroomlijnde techniek voor het snel produceren van kleine en grote epitheliale organoïden uit zowel muis- als menselijk borstweefsel, naast technieken voor organoïde inbedding in collageen en kelder extracellulaire matrix. Bovendien worden instructies voor in-gel fixatie en immunofluorescente kleuring gegeven met als doel de organoïde morfologie en dichtheid te visualiseren. Deze methodologieën zijn geschikt voor talloze downstream-analyses, zoals co-kweek met immuuncellen en ex vivo metastasemodellering via collageeninvasietest. Deze analyses dienen om het gedrag van celcellen beter op te helderen en een vollediger begrip te creëren van interacties binnen de micro-omgeving van de tumor.
Introduction
Het vermogen om epitheelcellen in vitro te modelleren is de basis geweest van modern biomedisch onderzoek omdat het cellulaire kenmerken vastlegt die in vivo niet toegankelijk zijn. Het kweken van epitheelcellijnen in een tweedimensionaal vlak kan bijvoorbeeld een beoordeling geven van de moleculaire veranderingen die optreden in een epitheelcel tijdens proliferatie1. Bovendien is het meten van de dynamische regulatie tussen signalering en genexpressie beperkt in in vivo systemen2. In kankeronderzoek heeft kankerepitheelcellijnmodellering de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire aanjagers van ziekteprogressie en potentiële medicijndoelen3. Het kweken van kankerepitheelcellijnen op een tweedimensionaal vlak heeft echter beperkingen, omdat de meeste genetisch vereeuwigd en gemodificeerd zijn, vaak klonaal van aard, geselecteerd op hun vermogen om te groeien in niet-fysiologische omstandigheden, beperkt in hun beoordeling van driedimensionale (3D) tumorweefselarchitectuur, en micro-omgevingsinteracties niet adequaat modelleren binnen een realistische weefselomgeving4. Deze beperkingen zijn vooral duidelijk bij het modelleren van metastase, die in vivo verschillende verschillende biologische stadia omvat, waaronder invasie, verspreiding, circulatie en kolonisatie op de verre orgaanlocatie5.
Kankerepitheelorganoïden zijn ontwikkeld om de 3D-omgeving en het gedrag van tumoren beter samen te vatten 6,7,8. Organoïden werden voor het eerst ontwikkeld uit enkele LRG5+ intestinale cryptecellen en gedifferentieerd om de 3D-structuur van crypt-villuseenheden weer te geven die de hiërarchische structuur van de dunne darm in vitrohandhaafden 9. Deze aanpak maakte real-time visualisatie en karakterisering van zelforganiserende weefselarchitectuur onder homeostatische en stressomstandigheden mogelijk. Als een natuurlijke uitbreiding werden kankerepitheelorganoïden ontwikkeld om veel verschillende soorten kanker te modelleren, waaronder colorectale 10, pancreas 11, borst12, lever13, long14, hersenen15 en maagkanker16. Kankerepitheliale organoïden zijn gebruikt om kankerevolutie17,18 en gemetastaseerd spatiotemporale gedrag 19,20 te karakteriseren en tumorheterogeniteit 21 te ondervragen en chemotherapieënte testen 22. Kankerepitheelorganoïden zijn ook geïsoleerd en verzameld tijdens lopende klinische onderzoeken om de respons van patiënten op antikankermiddelen en bestralingstherapie ex vivo 8,23,24,25 te voorspellen. Bovendien kunnen systemen met kankerepitheelorganoïden worden gecombineerd met andere niet-kankercellen, zoals immuuncellen, om een uitgebreider model van de tumormicro-omgeving te vormen om interacties in realtime te visualiseren, te ontdekken hoe kankerepitheelcellen de fundamentele aard van cytotoxische effector-immuuncellen zoals natuurlijke killercellen veranderen en potentiële immunotherapieën en antilichaamafhankelijke cytotoxische activiteit te testen26, 27,28. Dit artikel demonstreert een methode voor het genereren van epitheliale organoïden zonder passaging en inbedding in collageen en kelder extracellulaire matrix (ECM). Daarnaast worden ook technieken voor downstream beeldvorming van geïsoleerde organoïden gedeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de literatuur zijn verschillende methoden beschreven om tumororganoïden te genereren. Dit protocol belicht een methode voor het genereren van tumororganoïden rechtstreeks uit de tumor zonder te passeren. Met behulp van deze methode zijn tumororganoïden binnen enkele uren na het starten van de procedure produceerbaar en genereren ze bijna 100% levensvatbare organoïden in vergelijking met 70% gerapporteerd in de literatuur31. Ter vergelijking: andere methoden vereisen seriële passaging van c…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door financiering van METAvivor, de Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation en het NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. We erkennen de hulp van de University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, een gedeelde bron in het Simmons Comprehensive Cancer Center, die gedeeltelijk wordt ondersteund door het National Cancer Institute onder toekenningsnummer P30 CA142543. Speciale dank aan alle leden van het Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
Referenzen
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
