継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング
Summary
このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。
Abstract
オルガノイドは、その自己組織化特性と、初代組織または幹細胞からの増殖後の機能と構造の保持により、臓器組織をモデル化するための信頼できる方法です。このオルガノイド生成方法は、複数の継代による単一細胞分化を放棄し、代わりに差動遠心分離を使用して、機械的および酵素的に解離した組織から乳腺上皮オルガノイドを分離します。このプロトコルは、コラーゲンおよび基底細胞外マトリックスへのオルガノイド埋め込みの技術に加えて、マウスおよびヒト乳腺組織の両方から大小の上皮オルガノイドを迅速に生成するための合理化された技術を提供します。さらに、オルガノイドの形態と密度を視覚化する目的で、ゲル内固定と免疫蛍光染色の指示が提供されています。これらの方法論は、免疫細胞との共培養やコラーゲン浸潤アッセイによるex vivo転移モデリングなど、無数のダウンストリーム分析に適しています。これらの解析は、細胞間の挙動をよりよく解明し、腫瘍微小環境内の相互作用をより完全に理解するのに役立ちます。
Introduction
in vitroで上皮細胞をモデル化する能力は、in vivoではアクセスできない細胞の特徴を捉えるため、現代の生物医学研究の基礎となっています。例えば、2次元平面で増殖する上皮細胞株は、増殖中に上皮細胞で起こる分子変化の評価を提供することができます1。さらに、シグナル伝達と遺伝子発現との間の動的調節を測定することは、in vivoシステム2において制限される。がん研究において、がん上皮細胞株モデリングにより、疾患進行の分子ドライバーと潜在的な創薬標的の同定が可能になりました3。しかし、2次元平面上で増殖する癌上皮細胞株には限界があり、ほとんどが遺伝的に不死化および改変されており、多くの場合、本質的にクローンであり、非生理学的条件で増殖する能力のために選択され、3次元(3D)腫瘍組織構造の評価に制限があり、現実的な組織環境内での微小環境相互作用を適切にモデル化していない4。これらの制約は、インビボで、遠隔臓器部位での浸潤、播種、循環、およびコロニー形成を含むいくつかの異なる生物学的段階を含む転移のモデリングにおいて特に明白である5。
癌上皮オルガノイドは、腫瘍の3D環境および挙動をよりよく再現するために開発されてきた6、7、8。オルガノイドは、単一のLRG5+腸陰窩細胞から最初に開発され、in vitroで小腸の階層構造を維持する陰窩絨毛ユニットの3D構造を表すように分化しました9。このアプローチにより、恒常性およびストレス条件下での自己組織化組織構造のリアルタイムの視覚化と特性評価が可能になりました。自然な拡張として、結腸直腸癌10、膵臓11、乳房12、肝臓13、肺14、脳15、および胃癌16を含む多くの異なる癌タイプをモデル化するために癌上皮オルガノイドが開発されました。癌上皮オルガノイドは、癌の進化17,18および転移時空間行動19,20を特徴づけ、腫瘍の不均一性21を調査し、化学療法をテストするために利用されてきました22。癌上皮オルガノイドはまた、進行中の臨床試験中に単離および収集され、抗癌剤および放射線療法に対する患者の反応を予測するためにex vivoで8、23、24、25である。さらに、癌上皮オルガノイドを組み込んだ系を免疫細胞などの他の非癌細胞と組み合わせて、腫瘍微小環境のより包括的なモデルを形成して相互作用をリアルタイムで視覚化し、癌上皮細胞がナチュラルキラー細胞などの細胞傷害性エフェクター免疫細胞の基本的な性質をどのように変化させるかを明らかにし、潜在的な免疫療法および抗体薬物依存性細胞傷害活性を試験することができる26、27,28。本稿では、継代やコラーゲンおよび基底細胞外マトリックス(ECM)への埋め込みを行わずに上皮オルガノイドを生成する方法を示します。さらに、単離されたオルガノイドの下流イメージングのための技術も共有されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍オルガノイドを生成するための様々な方法が文献に記載されている。このプロトコルは、継代なしで腫瘍から直接腫瘍オルガノイドを生成する方法を強調しています。この方法を使用すると、腫瘍オルガノイドは、手順を開始してから数時間以内に生産可能であり、文献31で報告されている70%と比較して、ほぼ100%の生存可能なオルガノイドを生成します。比較すると、?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、METAvivor、Peter Carlson Trust、Theresa’s Research Foundation、NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543から提供された資金提供によって支援された。我々は、シモンズ総合がんセンターの共有リソースであるテキサス大学南西部組織管理共有リソースの支援を認め、授与番号P30 CA142543の下で国立がん研究所によって部分的に支援されています。チャンラボのすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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