Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem
Summary
Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.
Abstract
Os organoides são um método confiável para modelar o tecido do órgão devido às suas propriedades auto-organizadas e retenção de função e arquitetura após a propagação do tecido primário ou células-tronco. Este método de geração de organoides renuncia à diferenciação unicelular através de múltiplas passagens e, em vez disso, usa centrifugação diferencial para isolar organoides epiteliais mamários de tecidos dissociados mecanicamente e enzimaticamente. Este protocolo fornece uma técnica simplificada para a produção rápida de organoides epiteliais pequenos e grandes a partir de tecido mamário humano e camundongo, além de técnicas para incorporação de organoides no colágeno e na matriz extracelular do porão. Além disso, instruções para fixação em gel e coloração imunofluorescente são fornecidas com a finalidade de visualizar a morfologia e a densidade organoides. Essas metodologias são adequadas para uma miríade de análises a jusante, como a co-cultura com células imunes e a modelagem de metástases ex vivo por meio de ensaio de invasão de colágeno. Essas análises servem para elucidar melhor o comportamento célula-célula e criar uma compreensão mais completa das interações dentro do microambiente tumoral.
Introduction
A capacidade de modelar células epiteliais in vitro tem sido a base da pesquisa biomédica moderna, porque captura características celulares que não são acessíveis in vivo. Por exemplo, o crescimento de linhagens celulares epiteliais em um plano bidimensional pode fornecer uma avaliação das mudanças moleculares que ocorrem em uma célula epitelial durante a proliferação1. Além disso, a mensuração da regulação dinâmica entre sinalização e expressão gênica é limitada em sistemas in vivo 2. Na pesquisa do câncer, a modelagem da linhagem celular epitelial do câncer permitiu a identificação de fatores moleculares da progressão da doença e potenciais alvos de drogas3. No entanto, o crescimento de linhagens celulares epiteliais cancerígenas em um plano bidimensional tem limitações, pois a maioria é geneticamente imortalizada e modificada, muitas vezes de natureza clonal, selecionada por sua capacidade de crescer em condições não fisiológicas, limitada em sua avaliação da arquitetura do tecido tumoral tridimensional (3D) e não modela adequadamente as interações microambientais dentro de um ambiente tecidual realista4. Essas restrições são particularmente evidentes na modelagem de metástases, que in vivo inclui vários estágios biológicos distintos, incluindo invasão, disseminação, circulação e colonização no local distante do órgão5.
Organoides epiteliais cancerígenos têm sido desenvolvidos para melhor recapitular o ambiente 3D e o comportamento dos tumores 6,7,8. Os organoides foram desenvolvidos pela primeira vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ únicas e diferenciados para representar a estrutura 3D de unidades cripta-vilosas que mantiveram a estrutura hierárquica do intestino delgado in vitro9. Essa abordagem permitiu a visualização e caracterização em tempo real da arquitetura de tecidos auto-organizados sob condições homeostáticas e de estresse. Como uma extensão natural, os organoides epiteliais do câncer foram desenvolvidos para modelar muitos tipos diferentes de câncer, incluindo câncer colorretal 10, pancreático 11, mama 12, fígado 13, pulmão 14, cérebro 15 e câncer gástrico 16. Organoides epiteliais oncológicos têm sido explorados para caracterizar a evolução do câncer17,18 e comportamentos espaço-temporais metastáticos19,20 e interrogar a heterogeneidade tumoral21, e testar quimioterapias 22. Organoides epiteliais do câncer também foram isolados e coletados durante ensaios clínicos em andamento para predizer a resposta do paciente a agentes anticancerígenos e radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Além disso, os sistemas que incorporam organoides epiteliais cancerígenos podem ser combinados com outras células não cancerígenas, como células imunes, para formar um modelo mais abrangente do microambiente tumoral para visualizar interações em tempo real, descobrir como as células epiteliais cancerígenas alteram a natureza fundamental das células imunes efetoras citotóxicas, como as células natural killer, e testar potenciais imunoterapias e atividade citotóxica dependente de anticorpos26, 27,28. Este artigo demonstra um método de geração de organoides epiteliais sem passar e incorporar colágeno e matriz extracelular basal (MEC). Além disso, técnicas para imagens a jusante de organoides isolados também são compartilhadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes métodos têm sido descritos na literatura para gerar organoides tumorais. Este protocolo destaca um método para gerar organoides tumorais diretamente do tumor sem passar despercebido. Utilizando esse método, os organoides tumorais são produtíveis poucas horas após o início do procedimento e geram organoides próximos a 100% viáveis em comparação com 70% relatados na literatura31. Em comparação, outros métodos requerem a passagem em série de células em organoides ao longo …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo financiamento fornecido pelo METAvivor, o Peter Carlson Trust, a Theresa’s Research Foundation e o NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Reconhecemos a assistência do Recurso Compartilhado de Gerenciamento de Tecidos do Sudoeste da Universidade do Texas, um recurso compartilhado no Simmons Comprehensive Cancer Center, que é apoiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer sob o número de prêmio P30 CA142543. Agradecimentos especiais a todos os membros do Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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