Inductie van parodontitis via een combinatie van ligatuur en lipopolysaccharide-injectie in een rattenmodel
Summary
In deze studie wordt een rattenmodel van inductie van parodontitis gepresenteerd via een combinatie van retentieve ligatuur en repetitieve injecties van lipopolysaccharide afgeleid van Porphyromonas gingivalis, gedurende 14 dagen rond de eerste maxillaire kiezen. De ligatie- en LPS-injectietechnieken waren effectief in het induceren van peridontitis, resulterend in alveolair botverlies en ontsteking.
Abstract
Parodontitis (PD) is een veel voorkomende, chronische immuunontstekingsziekte van het parodontium, die resulteert in een verlies van gingivaal zacht weefsel, parodontale ligament, cementum en alveolair bot. In deze studie wordt een eenvoudige methode van PD-inductie bij ratten beschreven. We geven gedetailleerde instructies voor het plaatsen van het ligatuurmodel rond de eerste maxillaire kiezen (M1) en een combinatie van injecties met lipopolysaccharide (LPS), afgeleid van Porphyromonas gingivalis aan de mesio-palatale kant van de M1. De inductie van parodontitis werd gedurende 14 dagen gehandhaafd, waardoor de accumulatie van bacteriën, biofilm en ontsteking werd bevorderd. Om het diermodel te valideren, werd IL-1β, een belangrijke ontstekingsmediator, bepaald door een immunoassay in de gingivale creviculaire vloeistof (GCF) en werd het alveolaire botverlies berekend met behulp van cone beam computed tomography (CBCT). Deze techniek was effectief in het bevorderen van gingivarecessie, alveolair botverlies en een toename van IL-1β-niveaus in de GCF aan het einde van de experimentele procedure na 14 dagen. Deze methode was effectief in het induceren van PD en kon dus worden gebruikt in studies naar ziekteprogressiemechanismen en toekomstige mogelijke behandelingen.
Introduction
Parodontitis (PD) is de zesde meest voorkomende volksgezondheidsaandoening wereldwijd, die ongeveer 11% van de totale bevolking treft, een geavanceerde, onomkeerbare en destructieve vorm van parodontitis 1,2. PD is een ontstekingsproces dat de gingivale en parodontale weefsels aantast, wat resulteert in gingivarecessie, apicale migratie van het junctionele epitheel met pocketontwikkeling en het verlies van alveolair bot3. Bovendien wordt PD geassocieerd met verschillende systemische ziekten, waaronder hart- en vaatziekten, obesitas, diabetes en reumatoïde artritis, waarvoor omgevings- en gastheerspecifieke factoren een belangrijke rol spelen 4,5.
Vandaar dat PD een multifactoriële ziekte is die voornamelijk wordt geïnitieerd door de accumulatie van microbiële plaque – als gevolg van dysbiose van microbiële gemeenschappen – en door een overdreven immuunrespons van de gastheer op parodontale pathogenen, wat leidt tot de afbraak van parodontaal weefsel 4,6. Onder verschillende parodontale bacteriën is de gramnegatieve anaerobe bacterie Porphyromonas gingivalis een van de belangrijkste pathogenen in PD4. P. gingivalis bevat een complex lipopolysaccharide (LPS) in de wanden, een molecuul waarvan bekend is dat het polymorfonucleaire leukocyteninfiltratie en vasculaire dilatatie induceert in ontstoken parodontale weefsels7. Dit resulteert in de productie van ontstekingsmediatoren, zoals interleukine 1 (IL-1), IL-6 en IL-8, tumornecrosefactor (TNF) of prostaglandinen, met een daaropvolgende osteoclastische activering en botresorptie, wat leidt tot weefselvernietiging en uiteindelijk tandverlies3.
Een van de verschillende voordelen van diermodellen is het vermogen om cellulaire complexiteiten na te bootsen zoals bij mensen, of om nauwkeuriger te zijn dan in vitro studies, die worden uitgevoerd op plastic oppervlakken met beperkte celtypen8. Voor het experimenteel modelleren van PD in vivo zijn verschillende diersoorten gebruikt, zoals niet-menselijke primaten, honden, varkens, fretten, konijnen, muizen en ratten9. Ratten zijn echter het meest uitgebreid bestudeerde diermodel voor de pathogenese van PD omdat ze goedkoop en gemakkelijk te hanteren zijn10. Hun tandtandvlees heeft vergelijkbare structurele kenmerken als menselijk tandvleesweefsel, met een ondiepe gingivale sulcus en junctioneel epitheel bevestigd aan het tandoppervlak. Bovendien vergemakkelijkt het junctionele epitheel, net als bij mensen, de doorgang van bacteriële, vreemde materialen en exsudaten uit ontstekingscellen 9.
Een van de meest gerapporteerde experimentele modellen van PD-inductie bij ratten is de plaatsing van ligaturen rond de tanden, wat technisch uitdagend maar betrouwbaar is10. De ligatuurplaatsing vergemakkelijkt tandplak en bacteriële accumulatie, waardoor een dysbiose in de gingivale sulci ontstaat, die parodontale weefselontsteking en -vernietiging veroorzaakt11. Verlies van parodontale aanhechting en resorptie van alveolair bot kon in 7 dagen optreden bij deze rat model8.
Een ander diermodel voor PD bestaat uit de injectie van LPS in het tandvleesweefsel. Hierdoor worden osteoclastogenese en botverlies gestimuleerd. De histopathologische kenmerken van dit model zijn vergelijkbaar met door de mens vastgestelde PD, gekenmerkt door hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines, collageenafbraak en alveolaire botresorptie 6,8.
Het doel van deze studie was dus om een eenvoudig rattenmodel van experimentele PD te beschrijven op basis van de technieken van P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injecties, gecombineerd met ligatuurplaatsing rond de eerste maxillaire kiezen (M1). Dit is een model met vergelijkbare kenmerken als die waargenomen bij menselijke PD-ziekte, die kan worden gebruikt in de studie van ziekteprogressiemechanismen en toekomstige mogelijke behandelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode beschrijft de inductie van PD bij ratten na een gecombineerde techniek van Pg-LPS-injecties en ligatuurplaatsing rond de M1, waaruit blijkt dat significante veranderingen in de parodontale weefsels en het alveolaire bot binnen 14 dagen na deze methode kunnen worden geïnduceerd.
Tijdens deze procedure moet aandacht worden besteed aan verschillende kritieke stappen. Tijdens de anesthesie en de voorbereiding van de procedure is het beoordelen van de juiste anesthesie tijden…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), door het Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (contract met M.M.B; FI18/00104) en door de Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (contract met M.M.F.C; FPI/040/2020). De auteurs bedanken Dr. Anna Tomás en Maria Tortosa voor hun hulp bij de experimentele chirurgie en het platform van IdISBa. Tot slot, dank aan ADEMA School of Dentistry voor de toegang tot de CBCT-scanner.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referenzen
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
