쥐 모델에서 합자와 지질다당류 주입의 조합을 통한 치주염 유도
Summary
이 연구에서는 첫 번째 상악 어금니 주위에서 14일 동안 Porphyromonas gingivalis에서 추출한 지질다당류의 유지 합자와 반복 주사의 조합을 통해 치주염 유도의 쥐 모델을 제시합니다. 결찰 및 LPS 주사 기술은 치조골 손실과 염증을 유발하는 근막염 유도에 효과적이었습니다.
Abstract
치주염(PD)은 치주 연조직, 치주 인대, 시멘트질 및 치조골의 손실을 초래하는 매우 만연한 만성 면역 염증성 질환입니다. 본 연구에서는 랫트에서 PD를 유도하는 간단한 방법을 설명한다. 우리는 첫 번째 상악 어금니(M1) 주위에 합자 모델을 배치하고 M1의 근심-구개 쪽에 있는 Porphyromonas gingivalis 에서 파생된 지질다당류(LPS) 주사의 조합에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 치주염의 유도는 14일 동안 유지되어 박테리아 생물막의 축적과 염증을 촉진하였다. 동물 모델을 검증하기 위해 주요 염증 매개체인 IL-1β를 치은 틈새액(GCF)에서 면역분석법으로 측정하고 원뿔형 컴퓨터 단층촬영(CBCT)을 사용하여 치조골 손실을 계산했습니다. 이 기술은 14일 후 실험 절차 종료 시 치은 후퇴, 치조골 손실 및 GCF의 IL-1β 수준 증가를 촉진하는 데 효과적이었습니다. 이 방법은 파킨슨병 유도에 효과적이어서 질병 진행 기전 및 향후 가능한 치료법에 대한 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
치주염(PD)은 전 세계적으로 6번째로 널리 퍼진 공중 보건 질환으로, 전체 인구의 약 11%에 영향을 미치며, 진행성, 비가역적, 파괴적 형태의 치주 질환이다 1,2. PD는 치은 및 치주 조직에 영향을 미치는 염증 과정으로, 치은 후퇴, 포켓 발달을 동반한 접합 상피의 정점 이동, 치조골 손실을 초래합니다3. 또한, 파킨슨병은 심혈관 질환, 비만, 당뇨병 및 류마티스 관절염을 포함한 여러 전신 질환과 관련이 있으며, 환경 및 숙주 특이적 요인이 중요한 역할을 한다 4,5.
따라서, PD는 주로 미생물 군집의 dysbiosis로 인한 미생물 플라크의 축적과 치주 병원체에 대한 과장된 숙주 면역 반응에 의해 시작되어 치주 조직의 파괴를 초래하는 다인성 질환입니다 4,6. 여러 치주 박테리아 중에서 그람 음성 혐기성 박테리아인 Porphyromonas gingivalis는 PD4의 주요 병원체 중 하나입니다. P. gingivalis는 염증이 있는 치주 조직에서 다형핵 백혈구 침윤 및 혈관 확장을 유도하는 것으로 알려진 분자인 복합 지질다당류(LPS)를 벽에 함유하고 있다7. 그 결과 인터루킨 1(IL-1), IL-6, IL-8과 같은 염증 매개체, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 프로스타글란딘이 생성되어 파골세포가 활성화되고 뼈 흡수가 일어나 조직 파괴와 궁극적인 치아 손실이 발생합니다3.
동물 모델의 다양한 장점 중에는 인간에서와 같이 세포 복잡성을 모방할 수 있는 능력, 또는 제한된 세포 유형의 플라스틱 표면에서 수행되는 시험관 내 연구보다 더 정확하다는 점이 있다8. 생체 내에서 PD를 실험적으로 모델링하기 위해 인간이 아닌 영장류, 개, 돼지, 흰 족제비, 토끼, 생쥐 및 쥐와 같은 다양한 동물 종이 사용되었습니다9. 그러나, 래트는 파킨슨병의 발병기전에 대해 가장 광범위하게 연구된 동물 모델인데, 그 이유는 이들이 저렴하고 다루기 쉽기 때문이다10. 그들의 치은 조직은 인간의 치은 조직과 유사한 구조적 특징을 가지고 있으며, 얕은 치은 고랑과 접합 상피가 치아 표면에 부착되어 있습니다. 또한, 인간과 마찬가지로 접합 상피는 염증 세포에서 박테리아, 이물질 및 삼출물의 통과를 촉진한다 9.
쥐의 PD 유도에 대해 가장 많이 보고된 실험 모델 중 하나는 치아 주위에 합자를 배치하는 것인데, 이는 기술적으로 어렵지만 신뢰할 수 있습니다10. 합자 배치는 치태와 박테리아 축적을 촉진하여 치주 조직 염증 및 파괴를 유발하는 치은 고랑에 dysbiosis를 생성합니다11. 치주 부착의 상실 및 치조골의 재흡수는 이 쥐 모델8에서 7일 이내에 발생할 수 있다.
PD에 대한 또 다른 동물 모델은 치은 조직에 LPS를 주입하는 것으로 구성됩니다. 결과적으로 파골 세포 형성과 뼈 손실이 자극됩니다. 이 모델의 조직병리학적 특징은 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인, 콜라겐 분해 및 치조골 흡수를 특징으로 하는 인간이 확립한 PD와 유사합니다 6,8.
따라서 본 연구의 목적은 제1 상악 어금니(M1) 주위의 합자 배치와 결합된 P. gingivalis-LPS(Pg-LPS) 주사 기술을 기반으로 한 실험 PD의 간단한 쥐 모델을 설명하는 것이었습니다. 이것은 인간 PD 질환에서 관찰되는 것과 유사한 특성을 가진 모델로, 질병 진행 메커니즘 및 향후 가능한 치료법 연구에 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 Pg-LPS 주사와 M1 주위에 합자 배치를 결합한 기술에 따라 쥐에서 PD의 유도를 설명하며, 이 방법 후 14일 이내에 치주 조직과 치조골의 상당한 변화가 유도될 수 있음을 보여줍니다.
이 절차 중에 다른 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 동물 마취 및 시술 준비 중에 동물의 올바른 위치를 보장하고, 앞니 주위에 알루미늄 입 개그로 열린 쥐 입을 안정화하고…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (개념 증명 전화 2020), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, ESF 유럽 사회 기금 및 ERDF 유럽 지역 개발 기금 (M.M.B; FI18/00104) 및 Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear(M.M.F.C; FPI/040/2020)을 참조하십시오. 저자는 IdISBa의 실험적 수술 및 플랫폼에서 도움을 준 Anna Tomás 박사와 Maria Tortosa에게 감사드립니다. 마지막으로 CBCT 스캐너에 액세스할 수 있는 ADEMA School of Dentistry에 감사드립니다.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referenzen
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