Inducción de periodontitis mediante una combinación de ligadura e inyección de lipopolisacáridos en un modelo de rata
Summary
En este estudio, un modelo de rata de inducción de periodontitis se presenta a través de una combinación de ligadura retentiva e inyecciones repetitivas de lipopolisacárido derivado de Porphyromonas gingivalis, durante 14 días alrededor de los primeros molares maxilares. Las técnicas de ligadura e inyección de LPS fueron efectivas para inducir peridontitis, lo que resultó en pérdida ósea alveolar e inflamación.
Abstract
La periodontitis (EP) es una enfermedad inmunoinflamatoria crónica altamente prevalente del periodonto, que resulta en una pérdida de tejido blando gingival, ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar. En este estudio, se describe un método simple de inducción de EP en ratas. Proporcionamos instrucciones detalladas para la colocación del modelo de ligadura alrededor de los primeros molares maxilares (M1) y una combinación de inyecciones de lipopolisacárido (LPS), derivado de Porphyromonas gingivalis en el lado mesio-palatino del M1. La inducción de periodontitis se mantuvo durante 14 días, promoviendo la acumulación de biofilm bacteriano y la inflamación. Para validar el modelo animal, la IL-1β, un mediador inflamatorio clave, se determinó mediante un inmunoensayo en el líquido crevicular gingival (GCF), y la pérdida ósea alveolar se calculó mediante tomografía computarizada de haz cónico (CBCT). Esta técnica fue efectiva para promover la recesión gingiva, la pérdida ósea alveolar y un aumento en los niveles de IL-1β en el GCF al final del procedimiento experimental después de 14 días. Este método fue eficaz para inducir la EP, pudiendo así ser utilizado en estudios sobre mecanismos de progresión de la enfermedad y posibles tratamientos futuros.
Introduction
La periodontitis (EP) es la sexta condición de salud pública más prevalente a nivel mundial, afectando aproximadamente al 11% de la población total, siendo una forma avanzada, irreversible y destructiva de enfermedad periodontal 1,2. La EP es un proceso inflamatorio que afecta los tejidos gingival y periodontal, lo que resulta en recesión gingiva, migración apical del epitelio de unión con desarrollo de bolsas y pérdida de hueso alveolar3. Además, la EP está asociada a varias enfermedades sistémicas, como enfermedades cardiovasculares, obesidad, diabetes y artritis reumatoide, para las cuales los factores ambientales y específicos del huésped juegan un papel significativo 4,5.
Por lo tanto, la EP es una enfermedad multifactorial iniciada principalmente por la acumulación de placa microbiana – resultante de la disbiosis de las comunidades microbianas – y por una respuesta inmune exagerada del huésped a los patógenos periodontales, que conduce a la descomposición del tejido periodontal 4,6. Entre varias bacterias periodontales, la bacteria gramnegativa anaerobia Porphyromonas gingivalis es uno de los patógenos clave en la EP4. P. gingivalis contiene un complejo lipopolisacárido (LPS) en sus paredes, una molécula conocida por inducir infiltración de leucocitos polimorfonucleares y dilatación vascular en tejidos periodontales inflamados7. Esto resulta en la producción de mediadores inflamatorios, como la interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF) o prostaglandinas, con una posterior activación de osteoclastos y resorción ósea, lo que lleva a la destrucción del tejido y la pérdida final de dientes3.
Entre las diferentes ventajas de los modelos animales destacan la capacidad de imitar complejidades celulares como en humanos, o de ser más precisos que los estudios in vitro , que se realizan sobre superficies plásticas con tipos celulares limitados8. Para modelar la EP experimentalmente in vivo, se han utilizado diferentes especies animales, como primates no humanos, perros, cerdos, hurones, conejos, ratones y ratas9. Sin embargo, las ratas son el modelo animal más ampliamente estudiado para la patogénesis de la EP porque son baratas y fáciles de manejar10. Su tejido gingival dental tiene características estructurales similares al tejido gingival humano, con un surco gingival poco profundo y epitelio de unión unido a la superficie del diente. Además, como en los humanos, el epitelio de unión facilita el paso de bacterias, materiales extraños y exudados de células inflamatorias 9.
Uno de los modelos experimentales más reportados de inducción de EP en ratas es la colocación de ligaduras alrededor de los dientes, que es técnicamente desafiante pero confiable10. La colocación de la ligadura facilita la placa dental y la acumulación bacteriana, generando una disbiosis en los surcos gingivales, que causa inflamación y destrucción del tejido periodontal11. La pérdida de la inserción periodontal y la reabsorción del hueso alveolar podrían ocurrir en 7 días en este modelo de rata8.
Otro modelo animal para la EP consiste en la inyección de LPS en el tejido gingival. Como resultado, se estimulan la osteoclastogénesis y la pérdida ósea. Las características histopatológicas de este modelo son similares a la EP establecida en humanos, caracterizada por niveles más altos de citoquinas proinflamatorias, degradación del colágeno y resorción ósea alveolar 6,8.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue describir un modelo simple de rata de EP experimental basado en las técnicas de inyecciones de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinadas con la colocación de ligaduras alrededor de los primeros molares maxilares (M1). Se trata de un modelo con características similares a las observadas en la enfermedad de EP humana, que podría ser utilizado en el estudio de los mecanismos de progresión de la enfermedad y futuros posibles tratamientos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método describe la inducción de DP en ratas siguiendo una técnica combinada de inyecciones de Pg-LPS y colocación de ligaduras alrededor del M1, revelando que se podrían inducir cambios significativos en los tejidos periodontales y el hueso alveolar en 14 días después de este método.
Durante este procedimiento, se debe prestar atención a diferentes pasos críticos. Durante la anestesia animal y la preparación del procedimiento, evaluar la anestesia adecuada durante el p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha contado con el apoyo de la Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (convocatoria Prueba de concepto 2020), del Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciado por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (contrato con M.M.B; FI18/00104) y por la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (contrato con M.M.F.C; FPI/040/2020). Los autores agradecen a la Dra. Anna Tomás y María Tortosa su ayuda en la cirugía experimental y plataforma de IdISBa. Finalmente, gracias a la Facultad de Odontología de ADEMA por el acceso al escáner CBCT.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referenzen
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
